Quanti mesi dura l’immunità naturale contro il nuovo coronavirus SARS-CoV-2 secondo uno studio scientifico del 2021

La memoria immunitaria contro la sindrome respiratoria acuta grave coronavirus 2 (SARS-CoV-2) aiuta a determinare la protezione contro la reinfezione, il rischio di malattia e l’efficacia del vaccino. Utilizzando 188 casi umani nell’intervallo di gravità di COVID-19, Dan et al. ha analizzato i dati trasversali che descrivono la dinamica delle cellule B di memoria SARS-CoV-2, delle cellule T CD8 + e CD4 +cellule T per più di 6 mesi dopo l’infezione:

Gli autori hanno riscontrato un alto grado di eterogeneità nell’entità delle risposte immunitarie adattative che persistevano nella fase di memoria immunitaria al virus. Tuttavia, la memoria immunitaria in tre compartimenti immunologici è rimasta misurabile in più del 90% dei soggetti per più di 5 mesi dopo l’infezione. Nonostante l’eterogeneità delle risposte immunitarie, questi risultati mostrano che l’immunità duratura contro la malattia secondaria COVID-19 è una possibilità per la maggior parte degli individui. E’ quanto riportato nel mese di febbraio 2021 in uno studio pubblicato su science.org. La versione tradotta qui sotto:

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INTRODUZIONE

La memoria immunologica è la base per un’immunità protettiva duratura dopo infezioni o vaccinazioni. La durata della memoria immunologica dopo l’infezione da sindrome respiratoria acuta grave da coronavirus 2 (SARS-CoV-2) e COVID-19 non è chiara. La memoria immunologica può essere costituita da cellule B di memoria, anticorpi, cellule T CD4 + di memoria e/o cellule T CD8 + di memoria . La conoscenza della cinetica e delle interrelazioni tra questi quattro tipi di memoria negli esseri umani è limitata. Comprendere la memoria immunitaria per SARS-CoV-2 ha implicazioni per comprendere l’immunità protettiva contro COVID-19 e valutare il probabile corso futuro della pandemia di COVID-19.

FONDAMENTO LOGICO

La valutazione della memoria immunitaria specifica del virus per almeno un periodo di 6 mesi è probabilmente necessaria per accertare la durata della memoria immunitaria per SARS-CoV-2. Data l’evidenza che gli anticorpi, le cellule T CD4 + e le cellule T CD8 + possono tutti partecipare all’immunità protettiva contro SARS-CoV-2, abbiamo misurato gli anticorpi antigene-specifici, le cellule B di memoria, le cellule T CD4 + e le cellule T CD8 + nel sangue di soggetti guariti da COVID-19, fino a 8 mesi dopo l’infezione.

RISULTATI

Lo studio ha coinvolto 254 campioni di 188 casi di COVID-19, inclusi 43 campioni da 6 a 8 mesi dopo l’infezione. Cinquantuno soggetti nello studio hanno fornito campioni di sangue longitudinali, consentendo analisi sia trasversali che longitudinali della memoria immunitaria specifica per SARS-CoV-2. Gli anticorpi contro il picco di SARS-CoV-2 e il dominio di legame del recettore (RBD) sono diminuiti moderatamente in 8 mesi, paragonabile a molti altri rapporti. Le cellule B di memoria contro il picco di SARS-CoV-2 sono effettivamente aumentate tra 1 mese e 8 mesi dopo l’infezione. Le cellule T CD8 + di memoria e le cellule T CD4 + di memoria sono diminuite con un’emivita iniziale di 3-5 mesi. Questo è il più grande studio antigene-specifico fino ad oggi sui quattro principali tipi di memoria immunitaria per qualsiasi infezione virale.
Tra le risposte anticorpali, l’immunoglobulina G (IgG), l’RBD IgG e i titoli anticorpali neutralizzanti hanno mostrato una cinetica simile. Spike IgA era ancora presente nella grande maggioranza dei soggetti da 6 a 8 mesi dopo l’infezione. Tra le risposte delle cellule B di memoria, l’IgG era l’isotipo dominante, con una popolazione minore di cellule B di memoria IgA. Le cellule B di memoria IgM sembravano essere di breve durata. La memoria delle cellule CD8 + T e delle cellule T CD4 + è stata misurata per tutte le proteine ​​SARS-CoV-2. Sebbene circa il 70% degli individui possedesse una memoria rilevabile delle cellule CD8 + T a 1 mese dopo l’infezione, tale percentuale è scesa a circa il 50% da 6 a 8 mesi dopo l’infezione. Per CD4 +Memoria delle cellule T, il 93% dei soggetti aveva una memoria SARS-CoV-2 rilevabile a 1 mese dopo l’infezione e la percentuale di soggetti positivi per le cellule CD4 + T (92%) è rimasta elevata da 6 a 8 mesi dopo l’infezione. Sono state mantenute anche le cellule T CD4 + specifiche del picco SARS-CoV-2 con la capacità specializzata di aiutare le cellule B [cellule T helper follicolari (T FH )].
I diversi tipi di memoria immunitaria avevano ciascuno una cinetica distinta, risultando in complesse interrelazioni tra l’abbondanza di cellule T, cellule B e memoria immunitaria anticorpale nel tempo. Inoltre, è stata osservata una sostanziale eterogeneità nella memoria rispetto a SARS-CoV-2.

CONCLUSIONE

La memoria immunitaria sostanziale viene generata dopo COVID-19, coinvolgendo tutti e quattro i principali tipi di memoria immunitaria. Circa il 95% dei soggetti ha mantenuto la memoria immunitaria a circa 6 mesi dopo l’infezione. I titoli anticorpali circolanti non erano predittivi della memoria delle cellule T. Pertanto, i semplici test sierologici per gli anticorpi SARS-CoV-2 non riflettono la ricchezza e la durata della memoria immunitaria per SARS-CoV-2. Questo lavoro amplia la nostra comprensione della memoria immunitaria negli esseri umani. Questi risultati hanno implicazioni per l’immunità protettiva contro SARS-CoV-2 e COVID-19 ricorrente.
La memoria immunologica è costituita da anticorpi, cellule B di memoria, cellule T CD8 + di memoria e cellule T CD4 + di memoria .
Questo studio ha esaminato tutti i tipi di memoria immunitaria virus-specifica contro SARS-CoV-2 in soggetti COVID-19. Nella maggior parte degli individui è stata osservata una memoria immunitaria robusta.
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Astratto

Comprendere la memoria immunitaria per la sindrome respiratoria acuta grave coronavirus 2 (SARS-CoV-2) è fondamentale per migliorare la diagnostica e i vaccini e per valutare il probabile decorso futuro della pandemia di COVID-19. Abbiamo analizzato più compartimenti della memoria immunitaria circolante per SARS-CoV-2 in 254 campioni di 188 casi di COVID-19, inclusi 43 campioni a ≥6 mesi dopo l’infezione. L’immunoglobulina G (IgG) alla proteina spike era relativamente stabile per oltre 6 mesi. Le cellule B di memoria specifiche per il picco erano più abbondanti a 6 mesi che a 1 mese dopo l’insorgenza dei sintomi. Le cellule CD4 + T specifiche per SARS-CoV-2 e le cellule T CD8 + sono diminuite con un’emivita da 3 a 5 mesi. Studiando anticorpi, cellule B di memoria, cellule CD4 + T e CD8 + Memoria delle cellule T a SARS-CoV-2 in modo integrato, abbiamo osservato che ogni componente della memoria immunitaria SARS-CoV-2 mostrava una cinetica distinta.
La malattia da coronavirus 2019 (COVID-19), causata dalla nuova sindrome respiratoria acuta grave coronavirus 2 (SARS-CoV-2), è una malattia grave che ha provocato morbilità e mortalità globali diffuse. Gli esseri umani producono anticorpi specifici per SARS-CoV-2, cellule CD4 + T e cellule CD8 + T in risposta all’infezione da SARS-CoV-2 ( 1 – 4 ). Studi su pazienti affetti da COVID-19 acuti e convalescenti hanno osservato che le risposte delle cellule T sono associate a una riduzione della malattia ( 5 – 7 ), suggerendo che le cellule T CD4 + e CD8 + specifiche per SARS-CoV-2Le risposte delle cellule T possono essere importanti per il controllo e la risoluzione dell’infezione primaria da SARS-CoV-2. Inefficace immunità innata è stata fortemente associata ad una mancanza di controllo di infezione primaria SARS-CoV-2 e un elevato rischio di fatale COVID-19 ( 8 – 12 ), accompagnata da immunopatologia innata cella ( 13 – 18 ). Gli anticorpi neutralizzanti non sono generalmente correlati con la ridotta gravità della malattia COVID-19 ( 5 , 19 , 20 ), che è stata osservata anche per la sindrome respiratoria mediorientale (MERS), causata da MERS-CoV ( 21). Invece, anticorpi neutralizzanti sono associati con immunità protettiva contro infezioni secondarie con SARS-CoV-2 o SARS-CoV nei primati non umani ( 3 , 22 – 25 ). Trasferimento passivo di anticorpi neutralizzanti in anticipo di infezione (simulando condizioni preesistenti seguito all’esposizione secondaria) limita efficacemente tratto respiratorio (URT) infezione superiore, infezione del tratto respiratorio inferiore (polmone), e la malattia sintomatica in modelli animali ( 26 – 28 ). Il trasferimento passivo di anticorpi neutralizzanti forniti dopo l’inizio dell’infezione nell’uomo ha avuto effetti più limitati su COVID-19 ( 29 , 30), coerente con un ruolo sostanziale delle cellule T nel controllo e nell’eliminazione di un’infezione da SARS-CoV-2 in corso. Pertanto, lo studio degli anticorpi, delle cellule B di memoria, delle cellule CD4 + T e delle cellule T CD8 + per SARS-CoV-2 in modo integrato è probabilmente importante per comprendere la durata dell’immunità protettiva contro COVID-19 generata da SARS-CoV primario. -2 infezione ( 1 , 19 , 31 ).
Mentre l’immunità sterilizzante contro i virus può essere ottenuta solo da anticorpi neutralizzanti ad alto titolo, una protezione efficace contro la malattia clinica o la morte può essere ottenuta da molti altri scenari di memoria immunitaria. I possibili meccanismi di protezione immunologica possono variare in base alla cinetica relativa delle risposte della memoria immunitaria e dell’infezione. Ad esempio, l’epatite clinica dopo l’infezione da virus dell’epatite B (HBV) è prevenuta dalla memoria immunitaria provocata dal vaccino anche in assenza di anticorpi circolanti, a causa del decorso relativamente lento della malattia da HBV ( 32 , 33 ). Il decorso relativamente lento del COVID-19 grave nell’uomo [mediana 19 giorni dopo l’insorgenza dei sintomi (PSO) per i casi fatali ( 34]) suggerisce che l’immunità protettiva contro il COVID-19 secondario sintomatico o grave può coinvolgere compartimenti di memoria come le cellule T di memoria circolanti e le cellule B di memoria (che possono richiedere diversi giorni per riattivarsi e generare risposte di cellule T di richiamo e/o risposte anticorpali anamnestiche) ( 19 , 21 , 31 ).
La memoria immunitaria, sia dall’infezione primaria che dall’immunizzazione, è la fonte dell’immunità protettiva da un’infezione successiva ( 35 – 37 ). Pertanto, lo sviluppo del vaccino COVID-19 si basa sulla memoria immunologica ( 1 , 3 ). Nonostante studi approfonditi, la cinetica, la durata e l’evoluzione della memoria immunitaria negli esseri umani all’infezione o all’immunizzazione non sono in generale prevedibili sulla base della fase iniziale dell’effettore e le risposte immunitarie a breve tempo dopo la risoluzione dell’infezione non sono molto predittive di memoria a lungo termine ( 38 – 40 ). Pertanto, la valutazione delle risposte su un intervallo di 6 mesi o più è solitamente richiesta per accertare la durata della memoria immunitaria.
Una conoscenza approfondita della memoria immunitaria per SARS-CoV-2 richiede la valutazione dei suoi vari componenti, comprese le cellule B, le cellule CD8 + T e le cellule T CD4 + , poiché questi diversi tipi di cellule possono avere una cinetica della memoria immunitaria relativamente indipendente da ciascuna Altro. Comprendere le complessità della memoria immunitaria per SARS-CoV-2 è fondamentale per ottenere informazioni sulla probabilità di durata dell’immunità protettiva contro la reinfezione da SARS-CoV-2 e la malattia secondaria COVID-19. In questo studio, abbiamo valutato la memoria immunitaria di tutti e tre i rami dell’immunità adattativa (cellule CD4 + T, CD8 +cellule T e immunità umorale) in uno studio prevalentemente trasversale su 188 casi di COVID-19 guariti, che si estendevano fino a 8 mesi dopo l’infezione. I risultati hanno implicazioni per l’immunità contro il COVID-19 secondario e quindi il potenziale futuro corso della pandemia ( 41 , 42 ).

Coorte COVID-19

Abbiamo reclutato 188 persone con COVID-19 per questo studio. I soggetti (80 maschi, 108 femmine) rappresentavano una gamma di casi COVID-19 asintomatici, lievi, moderati e gravi ( Tabella 1 ) e sono stati reclutati da più siti negli Stati Uniti. La maggior parte dei soggetti proveniva dalla California o da New York. La maggior parte dei soggetti ha avuto un caso “lieve” di COVID-19, che non ha richiesto il ricovero. Il 93% dei soggetti non è mai stato ricoverato in ospedale per COVID-19; Il 7% dei soggetti è stato ricoverato, alcuni dei quali hanno richiesto cure in unità di terapia intensiva (ICU) ( Tabella 1 ). Questa distribuzione della gravità del caso era coerente con la distribuzione generale della gravità della malattia sintomatica tra i casi di COVID-19 negli Stati Uniti. Lo studio consisteva principalmente in casi di malattia sintomatica (97%, Tabella 1), a causa della natura del progetto di reclutamento per lo studio. L’età dei soggetti variava da 19 a 81 anni ( Tabella 1 ). La maggior parte dei soggetti ha fornito un campione di sangue in un singolo momento, tra 6 e 240 giorni di PSO ( Tabella 1 ), con 43 campioni a ≥6 mesi di PSO (178 giorni o più). Inoltre, 51 soggetti nello studio hanno fornito campioni di sangue longitudinali per una durata di diversi mesi (da due a quattro punti temporali; Tabella 1 ), consentendo la valutazione longitudinale della memoria immunitaria in un sottoinsieme della coorte.
COVID-19 ( N = 188 )
ETÀ (ANNI) da 19 a 81 (mediana = 40, IQR* = 18,75)
GENERE
 MASCHIO (%) 43% (80/188)
 FEMMINA (%) 57% (108/188)
CORSA
 AFROAMERICANO
 O NERO (%)
3% (5/188)
 ALASKAN NATIVE OR
AMERICAN INDIAN (%)
1% (1/188)
 ASIAN (%) 7% (14/188)
 NATIVE HAWAIIAN OR
PACIFIC ISLANDER (%)
0% (0/188)
 MULTIRACIAL (%) 1% (2/188)
 OTHER (%) 1% (1/188)
 UNKNOWN (%) 10% (19/188)
 WHITE (%) 78% (146/188)
ETHNICITY
 HISPANIC OR LATINO (%) 15% (28/188)
 NON-HISPANIC (%) 80% (150/188)
 UNKNOWN (%) 5% (10/188)
HOSPITALIZATION STATUS
 NEVER HOSPITALIZED (%) 93% (174/188)
 HOSPITALIZED (%) 7% (13/188)
 UNKNOWN IF HOSPITALIZED (%) 1% (1/188)
SAMPLE COLLECTION DATES March-October 2020
SARS-COV-2 PCR POSITIVITY
 POSITIVE 77% (145/188)
 NEGATIVE 1% (2/188)
 NOT PERFORMED 20% (37/188)
 UNKNOWN 2% (4/188)
PEAK DISEASE SEVERITY (%) [FEMALE (F), MALE (M)]
 ASYMPTOMATIC (SCORE 1) 2% (4/188) (2F, 2M)
 MILD (NONHOSPITALIZED; SCORE 2–3) 90% (170/188) (100F, 70M)
 MODERATE (HOSPITALIZED; SCORE 4–5) 3% (6/188) (3F, 3M)
 SEVERE (HOSPITALIZED; SCORE 6+) 4% (7/188) (3F, 4M)
 UNKNOWN 1% (1/188) (0F, 1M)
GIORNI DOPO L’INSORGENZA DEI SINTOMI AL MOMENTO DELLA RACCOLTA; N = 254 6-240 (mediana 88, IQR 97,75)
FREQUENZA DI RACCOLTA DEL SANGUE
 DONATORI A  PIÙ PUNTI TEMPORALI (DA DUE A QUATTRO VOLTE) 27% (51/188)
 DONATORI DI PUNTI SINGOLI 73% (137/188)

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Tabella 1 Caratteristiche dei partecipanti.

*IQR, intervallo interquartile.

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Anticorpi circolanti SARS-CoV-2 nel tempo

La stragrande maggioranza degli individui SARS-CoV-2-infettati seroconvert, almeno per una durata di mesi ( 1 , 2 , 4 , 43 – 45 ). I tassi di sieroconversione variano dal 91 al 99% in studi ampi ( 44 , 45 ). Le valutazioni della durata dei titoli anticorpali circolanti nella Fig. 1 si basavano su dati ≥20 giorni PSO, con il grafico del modello di adattamento della curva più adatto mostrato in blu (vedi materiali e metodi). I titoli del test immunoassorbente legato all’enzima (ELISA) dell’endpoint SARS-CoV-2 spike dell’immunoglobulina G (IgG) sono stati misurati per tutti i soggetti di questa coorte ( Fig. 1, A e B ). È stata anche misurata l’IgG del dominio di legame del recettore del picco (RBD) (Fig. 1, C e D ), poiché RBD è il bersaglio della maggior parte degli anticorpi neutralizzanti contro SARS-CoV-2 ( 4 , 27 , 46 , 47 ). I titoli anticorpali neutralizzanti dello pseudovirus SARS-CoV-2 (PSV) sono stati misurati in tutti i soggetti ( Fig. 1, E e F ). I titoli ELISA dell’endpoint Nucleocapside (N) IgG sono stati misurati anche per tutti i soggetti ( Fig. 1, G e H ), poiché il nucleocapside è un antigene comune nei kit di test sierologici SARS-CoV-2 commerciali.
Fig. 1 Anticorpi circolanti contro SARS-CoV-2 nel tempo.
A ) Spike IgG trasversali da campioni di plasma soggetti a COVID-19 ( n = 228). Modello preferito di decadimento continuo per la curva di miglior adattamento, 1/2 = 140 giorni; IC 95%: da 89 a 325 giorni. R = -0,23, p = 0,0006. ( B ) Spike longitudinale IgG ( n = 51), 1/2 = 103 giorni medio ; 95% CI: da 65 a 235 giorni. ( C ) RBD IgG in sezione trasversale. Modello preferito di decadimento continuo per la curva di miglior adattamento, 1/2 = 83 giorni; IC 95%: da 62 a 126 giorni. R = -0,36, p < 0,0001. ( D ) RBD longitudinale IgG, mediat1/ 2 = 69 giorni; IC 95%: da 58 a 87 giorni. ( E ) Titoli di neutralizzazione del PSV SARS-CoV-2 trasversali. Modello preferito di decadimento monofase (linea blu) per la curva di miglior adattamento, 1/2 iniziale = 27 giorni; IC 95%: da 11 a 157 giorni. R = -0,32. Linea di adattamento del decadimento continuo mostrata come linea nera. ( F ) Titoli longitudinali di neutralizzazione del PSV di soggetti infetti da SARS-CoV-2, t medio di 1/2 = 90 giorni; IC 95%: da 70 a 125 giorni. ( G ) IgG nucleocapside in sezione trasversale. Modello preferito di decadimento continuo per la curva di miglior adattamento, 1/2 = 68 giorni; IC 95%: da 50 a 106 giorni. R = -0,34, p < 0,0001. (H ) IgG nucleocapside longitudinale, 1/2 = 68 giorni medio ; 95% CI: da 55 a 90 giorni. ( I ) Titoli di IgA di picco trasversali. Modello preferito di decadimento a una fase (linea blu) per la curva di miglior adattamento, 1/2 iniziale = 11 giorni; IC 95%: da 5 a 25 giorni. R = -0,30. Adattamento del decadimento continuo mostrato come linea nera. ( J ) Picco longitudinale IgA, 1/2 = 210 giorni, 95% CI da 126 a 627 giorni. ( K ) RBD IgA in sezione trasversale. Modello preferito di decadimento monofase (linea blu) per la curva di miglior adattamento, 1/2 iniziale = 27 giorni; IC 95%: da 15 a 59 giorni. R = -0,45. Adattamento della linea di decadimento continuo mostrato in nero. (L ) RBD IgA longitudinale, media 1/2 = 74 giorni; IC 95%: da 56 a 107 giorni. Per le analisi trasversali, soggetti infetti da SARS-CoV-2 (cerchi bianchi, n = 238) e soggetti non esposti (cerchi grigi, n = 51). Per i campioni longitudinali, soggetti SARS-CoV-2 ( n = 51). La linea tratteggiata nera indica il limite di rilevamento (LOD). La linea verde tratteggiata indica il limite di sensibilità (LOS) sopra i controlli non infetti. I soggetti non esposti sono rappresentati in grigio, i soggetti COVID in bianco. Dati di registro analizzati in tutti i casi. La linea blu spessa rappresenta la curva di adattamento migliore. Quando vengono mostrate due curve di adattamento, la sottile linea nera rappresenta la curva di adattamento alternativa.
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I titoli di IgG spike SARS-CoV-2 erano relativamente stabili da 20 a 240 giorni di PSO, quando si valutavano tutti i soggetti COVID-19 mediante analisi della sezione trasversale (emivita 1/2 = 140 giorni, Fig. 1A ). I titoli di Spike IgG erano eterogenei tra i soggetti (intervallo da 5 a 73.071; mediana 575), come è stato ampiamente osservato ( 45 , 47 ). Ciò ha fornito un ampio intervallo di confidenza (CI) per lo spike IgG 1/2 (IC 95%: da 89 a 325 giorni). Sebbene le risposte anticorpali possano avere una cinetica di decadimento sottostante più complessa, la curva di adattamento migliore era un decadimento continuo, probabilmente correlato all’eterogeneità tra gli individui. La cinetica delle IgG del nucleocapside SARS-CoV-2 era simile a quella dello spike IgG nell’arco di 8 mesi ( t1/ 268 giorni; 95% CI: da 50 a 106 giorni, Fig. 1G ). Come approccio complementare, utilizzando campioni appaiati dal sottogruppo di soggetti che hanno donato in due o più momenti, la media del titolo di IgG di picco calcolata 1/2 era di 103 giorni, (95% CI: da 66 a 235 giorni; Fig. 1B ) e IgG nucleocapside titolo medio 1/2 era di 68 giorni, (95% CI: 55 a 90 giorni; Fig 1H. ). La percentuale di soggetti sieropositivi per spike IgG a 1 mese di PSO (da 20 a 50 giorni) è stata del 98% (54 su 55). La percentuale di soggetti sieropositivi per spike IgG a 6-8 mesi di PSO (≥178 giorni) è stata del 90% (36 su 40).
L’analisi della sezione trasversale dei titoli di IgG di SARS-CoV-2 RBD da 20 a 240 giorni di PSO ha dato una stima di 1/2 di 83 giorni (IC 95%: da 62 a 126 giorni; Fig. 1C ). Come approccio complementare, abbiamo nuovamente utilizzato campioni accoppiati, che hanno fornito una 1/2 media di 69 giorni (IC 95%: da 58 a 87 giorni; Fig. 1D ). La percentuale di soggetti sieropositivi per RBD IgG a 6-8 mesi di PSO è stata dell’88% (35 su 40). Pertanto, il mantenimento del titolo di RBD IgG corrispondeva ampiamente a quello di spike IgG. I titoli di neutralizzazione di SARS-CoV-2 PSV nell’intera coorte corrispondevano in gran parte ai risultati dei titoli di legame SARS-CoV-2 RBD IgG ELISA ( Fig. 1, E e F ). Un modello di decadimento a una fase era il miglior adattamento ( P = 0,015, test F; decadimento iniziale1/2 27 giorni, seguito da una fase di plateau estesa, Fig. 1E ), mentre un adattamento di decadimento continuo ha dato una stima di 1/2 di 114 giorni ( Fig. 1E , linea nera). L’analisi dei punti temporali appaiati dei titoli di neutralizzazione del PSV ha dato una stima 1/2 di 90 giorni, (95% CI: da 70 a 125 giorni; Fig. 1F ). La percentuale di soggetti sieropositivi per anticorpi neutralizzanti SARS-CoV-2 (titolo ≥20) a 6-8 mesi di PSO è stata del 90% (36 su 40). In particolare, anche bassi titoli anticorpali neutralizzanti circolanti (≥1:20) erano associati a un sostanziale grado di protezione contro COVID-19 nei primati non umani ( 24 , 48).). Pertanto, modeste quantità di anticorpi neutralizzanti SARS-CoV-2 circolanti sono di interesse biologico nell’uomo.
Sono stati anche valutati i titoli di SARS-CoV-2 spike IgA ( Fig. 1, I e J ) e RBD IgA ( Fig. 1, K e L ). L’analisi di punti temporali appaiati dei titoli di IgA di picco ha prodotto una 1/2 stimata di 210 giorni (95% CI da 126 a 703 giorni, Fig. 1J ). L’analisi in sezione trasversale di spike IgA si adatta a un breve modello di decadimento a una fase con una fase di plateau estesa ( 1/2 iniziale di 14 giorni, Fig. 1I ). L’RBD IgA circolante aveva una 1/2 iniziale stimata di 27 giorni, decadendo di ~90 giorni nella maggior parte dei casi COVID-19 a livelli indistinguibili da quelli dei controlli non infetti ( Fig. 1K ), coerenti con le osservazioni 3 mesi PSO ( 4449 ). Mediante analisi di campioni appaiati, in alcuni soggetti è stata ottenuta IgA RBD di lunga durata, ma spesso vicino al limite di sensibilità (LOS) ( Fig. 1L ).

Cellule B di memoria SARS-CoV-2

Per identificare le cellule B di memoria specifiche per SARS-CoV-2, abbiamo utilizzato sonde multimerizzate marcate con fluorescenza per rilevare le cellule B specifiche per spike, RBD e nucleocapside ( Fig. 2A e Fig. S1). Le cellule B di memoria leganti l’antigene (definite come IgD  e/o CD27 + ) sono state ulteriormente distinte in base agli isotipi di Ig di superficie: IgM, IgG o IgA ( Fig. 2B e fig. S1).
Fig. 2 Cinetica delle risposte delle cellule B di memoria SARS-CoV-2.
A ) Esempi di grafici di citometria a flusso che mostrano modelli di colorazione delle sonde dell’antigene SARS-CoV-2 su cellule B di memoria (vedi fig. S1 per gating). Sono mostrati un donatore non esposto e tre soggetti convalescenti COVID-19. I numeri indicano le percentuali. ( B ) Strategie di gating per definire le cellule B di memoria specifiche del picco IgM + , IgG + o IgA + SARS-CoV-2. Le stesse strategie di gating sono state utilizzate per le cellule B specifiche per RBD o nucleocapside. ( C ) Analisi della sezione trasversale della frequenza (percentuale di cellule CD19 + CD20 + B) del totale specifico del picco SARS-CoV-2 (IgG + , IgM + o IgA +) cellule B di memoria. Modello cinetico di pseudo-primo ordine per la curva di miglior adattamento ( R = 0,38). ( D ) Analisi longitudinale delle cellule B di memoria specifiche per spike SARS-CoV-2. ( E ) Analisi della sezione trasversale delle cellule B di memoria totali specifiche per SARS-CoV-2 RBD (IgG + , IgM + o IgA + ). Modello polinomiale del secondo ordine per la curva di miglior adattamento ( R = 0,46). ( F ) Analisi longitudinale delle cellule B di memoria specifiche per SARS-CoV-2 RBD. ( G ) Analisi della sezione trasversale del totale specifico del nucleocapside SARS-CoV-2 (IgG + , IgM + o IgA +) cellule B di memoria. Modello cinetico di pseudo-primo ordine per la curva di miglior adattamento ( R = 0,44). ( H ) Analisi longitudinale delle cellule B di memoria specifiche del nucleocapside IgG + SARS-CoV-2. ( I ) Analisi della sezione trasversale delle IgG + cellule B di memoria specifiche per SARS-CoV-2 . Modello cinetico di pseudo-primo ordine per la curva di miglior adattamento ( R = 0,49). ( J ) Analisi longitudinale delle cellule IgG + memoria B specifiche per SARS-CoV-2 . ( K ) Analisi della sezione trasversale delle cellule IgA + memoria B specifiche per SARS-CoV-2 . Modello polinomiale del secondo ordine per la curva di miglior adattamento (| R | = 0,32). ( L) Analisi longitudinale di IgA + cellule B di memoria specifiche per SARS-CoV-2 . ( M ) Analisi della sezione trasversale delle cellule B di memoria + IgM specifiche per spike SARS-CoV-2 . Modello polinomiale del secondo ordine per la curva di miglior adattamento (| R | = 0,41). ( N ) Analisi longitudinale delle cellule B di memoria + IgM specifiche per spike SARS-CoV-2 . ( O ) Frazione di cellule B di memoria specifiche dell’antigene SARS-CoV-2 che appartengono agli isotipi di Ig indicati a 1-8 mesi di PSO. Media ± SEM. ( P ) Analisi della sezione trasversale delle cellule B di memoria + IgG specifiche per RBD SARS-CoV-2 . Modello polinomiale del secondo ordine per la curva di miglior adattamento (| R | = 0,51). ( Q) Analisi della sezione trasversale di IgG + cellule B di memoria specifiche per il nucleocapside SARS-CoV-2 . Modello polinomiale del secondo ordine per la curva di miglior adattamento (| R | = 0,51). n = 20 soggetti non esposti (cerchi grigi) e n = 160 soggetti COVID-19 ( n = 197 punti dati, cerchi bianchi) per l’analisi trasversale. n = 36 soggetti COVID-19 ( n = 73 punti dati, cerchi bianchi) per l’analisi longitudinale. La linea tratteggiata nera indica LOD. La linea verde tratteggiata indica LOS.
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L’analisi della sezione trasversale dei soggetti COVID-19 ha rivelato che le frequenze delle cellule B di memoria specifiche del picco SARS-CoV-2 sono aumentate nei primi ~ 120 giorni di PSO e poi si sono stabilizzate (modello di pseudo-primo ordine per la curva di migliore adattamento, R = 0,38 ; migliore adattamento rispetto al modello polinomiale del secondo ordine secondo il criterio informativo di Akaike; Fig. 2C e Fig. S2A). Le frequenze delle cellule B di memoria specifiche per il picco sono aumentate dal primo punto temporale (da 36 a 163 giorni) al secondo punto temporale (da 111 a 240 giorni) in campioni accoppiati da 24 di 36 donatori tracciati longitudinalmente ( Fig. 2D ). Le cellule B di memoria specifiche per il picco nei soggetti SARS-CoV-2 non esposti erano rare (mediana 0,0078%; Fig. 2, A e C ).
Le cellule B di memoria specifiche per RBD hanno mostrato una cinetica simile alle cellule B di memoria specifiche per il picco. Le cellule B di memoria specifiche per RBD non erano rilevabili nei soggetti SARS-CoV-2 non esposti ( Fig. 2E e Fig. S2C), come previsto. Le cellule B di memoria specifiche per RBD sono apparse già a 16 giorni di PSO e la frequenza è aumentata costantemente nei successivi 4-5 mesi ( Fig. 2E e fig. S2, B e C). Ventinove dei 36 individui tracciati longitudinalmente avevano frequenze più elevate di cellule B di memoria specifiche per RBD in un secondo momento ( Fig. 2F ), mostrando nuovamente un aumento delle cellule B di memoria specifiche per SARS-CoV-2 diversi mesi dopo l’infezione. Circa il 10-30% delle cellule B di memoria specifiche per il picco da donatori convalescenti SARS-CoV-2 erano specifiche per il dominio RBD ( Fig. 2Ae fig. S2B).
Cellule B di memoria specifiche del nucleocapside SARS-CoV-2 sono state rilevate anche dopo l’infezione da SARS-CoV-2 ( Fig. 2A ). Simile alle cellule B di memoria specifiche per spike e RBD, la frequenza delle cellule B di memoria specifica per nucleocapside è aumentata costantemente durante i primi ~4-5 mesi di PSO ( Fig. 2, G e H e Fig. S2D). La maturazione dell’affinità anticorpale potrebbe potenzialmente spiegare l’aumento delle frequenze delle cellule B di memoria specifiche per SARS-CoV-2 rilevate dalle sonde dell’antigene. Tuttavia, l’intensità fluorescente media geometrica (MFI) del legame della sonda era stabile nel tempo (fig. S2, I e J), ​​non supportando una spiegazione della maturazione dell’affinità per l’aumento delle frequenze delle cellule B di memoria.
La rappresentazione degli isotipi di Ig tra la popolazione di cellule B di memoria specifica per spike SARS-CoV-2 si è spostata nel tempo ( Fig. 2, da I a O ). Durante la prima fase della memoria (da 20 a 60 giorni PSO), gli isotipi IgM + e IgG + erano rappresentati in modo simile ( Fig. 2O ), ma le cellule IgM + memoria B sono poi diminuite ( Fig. 2, da M a O ) e IgG + cellule B di memoria specifiche per il picco quindi dominate da 6 mesi di PSO ( Fig. 20 ). IgA + cellule B di memoria specifiche per il picco sono state rilevate come una piccola frazione delle celle B di memoria specifiche per il picco totali (~5%, Fig. 20 ). IgG +la frequenza delle cellule B di memoria specifica per il picco è aumentata, mentre la frequenza di IgA + era bassa e stabile nel periodo di 8 mesi ( Fig. 2, da I a L ). Schemi simili di aumento della memoria IgG + , memoria IgM + di breve durata e memoria IgA + stabile sono stati osservati per le cellule B di memoria specifiche per RBD e nucleocapside nel periodo di 8 mesi ( Fig. 2, da O a Q e fig. S2, da E a H).
Vi è una conoscenza limitata della cinetica delle cellule B di memoria a seguito di un’infezione virale acuta primaria nell’uomo. Uno studio SARS-CoV-2 pubblicato di recente ha trovato cellule B di memoria specifiche per RBD fino a ~ 90 giorni di PSO, con frequenze crescenti (e una bassa frequenza di cellule IgA + ) ( 50 ), coerentemente con le osservazioni qui riportate. Per altre malattie infettive acute, non siamo attualmente a conoscenza di altre analisi trasversali o longitudinali di cellule B di memoria antigene-specifiche mediante citometria a flusso che coprano una finestra di 6+ mesi dopo l’infezione, ad eccezione di quattro individui con Ebola ( 51 ) e due individui studiati dopo l’immunizzazione del virus della febbre gialla ( 52) (escludiamo i vaccini antinfluenzali per il confronto qui, perché le persone hanno numerose esposizioni e una complessa storia immunitaria all’influenza). Nello studio sulla febbre gialla, nei due individui sono state osservate IgM + memoria di breve durata e cellule B di memoria a commutazione di isotipo di più lunga durata. Nel complesso, sulla base delle osservazioni qui riportate, lo sviluppo della memoria delle cellule B in SARS-CoV-2 è stato robusto e probabilmente di lunga durata.

SARS-CoV-2 memoria CD8 + cellule T

SARS-CoV-2 memory CD8+ T cells were measured in 169 COVID-19 subjects using a series of 23 peptide pools covering the entirety of the SARS-CoV-2 ORFeome (25). The most commonly recognized open reading frames (ORFs) were spike, membrane (M), nucleocapsid, and ORF3a (CD69+ CD137+Fig. 3A and fig. S3, A and B), consistent with our previous study (2). The percentage of subjects with detectable circulating SARS-CoV-2 memory CD8+ T cells at 1 month PSO (20 to 50 days) was 70% (40 out of 57, Fig. 3B). The proportion of subjects positive for SARS-CoV-2 memory CD8+Le cellule T a ≥6 mesi la PSO era del 50% (18 su 36). Ciò potrebbe potenzialmente sottostimare la memoria delle cellule CD8 + T, poiché i peptidi 15-mer possono essere subottimali per il rilevamento di alcune cellule T CD8 + antigene-specifiche ( 53 ); tuttavia, pool di epitopi di classe I di SARS-CoV-2 previsti di dimensioni ottimali hanno rilevato anche cellule CD8 + T virus-specifiche in circa il 70% degli individui da 1 a 2 mesi di PSO, indicando la coerenza tra i due approcci sperimentali ( 2 ).
Fig. 3 SARS-CoV-2 memoria circolante CD8 + cellule T.
A ) Grafici rappresentativi di citometria a flusso di cellule CD8 + T specifiche per SARS-CoV-2 (CD69 + CD137 + ; vedere la figura S3 per gating) dopo stimolazione notturna con pool di peptidi S, N, M, ORF3a o nsp3, confrontati al controllo negativo (DMSO). ( B ) Analisi trasversale della frequenza (percentuale di cellule CD8 + T) delle cellule CD8 + T specifiche per SARS-CoV-2 totali . Modello di adattamento preferito a decadimento continuo, 1/2 = 125 giorni. R = -0,24, p = 0,0003. ( C ) Analisi longitudinale delle cellule CD8 + T specifiche per SARS-CoV-2 totali in campioni accoppiati. ( D) Analisi della sezione trasversale di cellule CD8 + T spike-specifiche . Modello preferito di decadimento lineare, 1/2 = 225 giorni. R = -0,18, p = 0,007. ( E ) Analisi longitudinale di cellule CD8 + T spike-specifiche in campioni appaiati. ( F e G ) Distribuzione della memoria centrale (T CM ), della memoria effettrice (T EM ) e delle cellule di memoria effettrici terminalmente differenziate (T EMRA ) tra le cellule CD8 + T specifiche per SARS-CoV-2 . n = 169 soggetti COVID-19 ( n= 215 punti dati, cerchi bianchi) per l’analisi della sezione trasversale. n = 37 soggetti COVID-19 ( n = 83 punti dati, cerchi bianchi) per l’analisi longitudinale. La linea tratteggiata nera indica LOD. La linea verde tratteggiata indica LOS.
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SARS-CoV-2 di memoria CD8 + cellule T diminuiti con un’apparente 1/2 di 125 giorni in pieno coorte ( Fig. 3B ) e 1/2 190 giorni tra 29 campioni accoppiati ( Fig. 3C ). Memoria spike-specifica CD8 + cellule T esposte cinetica simile alla memoria SARS-CoV-2-specifico complessivo CD8 + cellule T ( 1/2 225 giorni per l’intera coorte e 185 giorni tra campioni accoppiati; Fig. 3, D e E , rispettivamente). I marcatori fenotipici hanno indicato che la maggior parte delle cellule CD8 + T di memoria specifiche per SARS-CoV-2 erano cellule di memoria effettrici differenziate terminalmente (T EMRA) ( 54 ), con piccole popolazioni di memoria centrale (T CM ) e memoria effettrice ( T EM ) ( Fig. 3, F e G ). Nel contesto dell’influenza, le cellule CD8 + T EMRA sono state associate alla protezione contro malattie gravi negli esseri umani ( 55 ). Le emivite delle cellule T CD8 + di memoria osservate qui erano paragonabili ai 123 giorni t1/ 2 osservate per le cellule T CD8 + di memoria dopo l’immunizzazione contro la febbre gialla ( 56 ). Pertanto, la cinetica del CD8 + . specifico per SARS-CoV-2 circolante Le cellule T erano coerenti con quanto riportato per un altro virus che causa infezioni acute nell’uomo.

SARS-CoV-2 memoria CD4 + cellule T

Le cellule CD4 + T di memoria SARS-CoV-2 sono state identificate in 169 soggetti utilizzando la stessa serie di 23 pool di peptidi che coprono l’ORFeome SARS-CoV-2 ( 2 , 5 ). Gli ORF più comunemente riconosciuti erano spike, M, nucleocapside, ORF3a e nsp3 (CD137 + OX40 + ; Fig. 4A e fig. S4, A e B), coerenti con il nostro studio precedente ( 2 ). Le risposte circolanti delle cellule CD4 + T della memoria SARS-CoV-2 erano piuttosto robuste ( Fig. 4B ); Il 42% (24 su 57) dei casi di COVID-19 a 1 mese di PSO aveva cellule CD4 + T specifiche per SARS-CoV-2 > 1,0% . Le cellule CD4 + T di memoria SARS-CoV-2 sono diminuite con un t . apparente1/2 di 94 giorni nell’intera coorte ( Fig. 4B ) e 64 giorni tra 36 campioni accoppiati ( Fig. 4C ). La percentuale di soggetti con cellule CD4 + T di memoria SARS-CoV-2 circolanti rilevabili a 1 mese di PSO (da 20 a 50 giorni) era del 93% (53 su 57, Fig. 4B ). La percentuale di soggetti positivi per le cellule CD4 + T di memoria SARS-CoV-2 a ≥6 mesi di PSO è stata del 92% (33 su 36).
Fig. 4 Cellule T CD4 + T circolanti di SARS-CoV-2 .
A ) Grafici rappresentativi della citometria a flusso di cellule CD4 + T specifiche per SARS-CoV-2 (CD137 + OX40 + ; vedere la figura S4 per gating) dopo stimolazione notturna con pool di peptidi S, N, M, ORF3a o nsp3, confrontati al controllo negativo (DMSO). ( B ) Analisi trasversale della frequenza (percentuale di cellule CD4 + T) delle cellule CD4 + T specifiche per SARS-CoV-2 totali . Modello di adattamento preferito a decadimento continuo, 1/2 = 94 giorni. R = -0,29, p < 0,0001. ( C ) Analisi longitudinale del totale CD4 + . specifico per SARS-CoV-2Cellule T in campioni appaiati degli stessi soggetti. ( D ) Analisi della sezione trasversale di cellule CD4 + T specifiche per spike . Modello preferito di decadimento lineare, 1/2 = 139 giorni. R = -0,26, p < 0,0001. ( E ) Analisi longitudinale di cellule CD4 + T spike-specifiche in campioni accoppiati degli stessi soggetti. ( F e G ) Distribuzione della memoria centrale (T CM ), della memoria effettrice (T EM ) e delle cellule di memoria effettrici terminalmente differenziate (T EMRA ) tra le cellule CD4 + T specifiche per SARS-CoV-2 . ( H eI ) Quantificazione delle cellule T helper follicolare (cT FH ) circolanti specifiche per SARS-CoV-2 (superficie CD40L + OX40 + , come percentuale di cellule CD4 + T; vedi fig. S5 per gating) dopo stimolazione notturna con picco (H) (S) o (I) pool di peptidi MP_R. ( J ) PD-1 hi T FH specifico per SARS-CoV-2 a 1 o 2 mesi (mese) e 6 mesi PSO. ( K ) CCR6 + cT FH specifico per SARS-CoV-2 rispetto alle cellule FH cT sfuse nel sangue. Per (A) a (E), n = 169 soggetti COVID-19 ( n = 215 punti dati, cerchi bianchi) per l’analisi della sezione trasversale,n = 37 soggetti COVID-19 ( n = 83 punti dati, cerchi bianchi) per l’analisi longitudinale. La linea tratteggiata nera indica il limite di rilevamento. La linea verde tratteggiata indica LOS. Per (H) a (J), n = 29 campioni di soggetti COVID-19 (cerchi bianchi), n = 17 soggetti COVID-19 da 1 a 2 mesi, n = 12 soggetti COVID-19 a 6 mesi. La linea tratteggiata nera indica LOD. Statistiche di (J) Mann-Whitney U test e (K) Wilcoxon test dei ranghi con segno. * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001. ns, non statisticamente significativo.
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Memoria spike-specifico e M-specifico CD4 + T cellule esposte cinetica simile alla complessiva SARS-CoV-2-specifico memoria CD4 + cellule T (intera coorte 1/2 di 139 giorni e 153 giorni, rispettivamente; Fig 4,. D ed E , e fig. S4D). Una pluralità di SARS-CoV-2 memoria CD4 + T cellule presenti ≥6 mesi PSO aveva una T CM fenotipo ( Fig. 4F ).
Le cellule T follicular helper (T FH ) sono il sottoinsieme specializzato di cellule CD4 + T necessarie per l’aiuto delle cellule B ( 57 ) e sono quindi fondamentali per la generazione di anticorpi neutralizzanti e per l’immunità umorale di lunga durata nella maggior parte dei contesti. Pertanto, abbiamo esaminato le cellule CD4 + T di memoria T FH (cT FH ) circolanti , con particolare interesse per le cellule cT FH di memoria specifiche per lo spike , a causa dell’importanza delle risposte anticorpali contro lo spike. Sono state misurate anche le cellule FH di memoria cT specifiche per gli epitopi previsti attraverso il resto del genoma SARS-CoV-2, utilizzando il megapool MP_R. Memoria cT FHcellule specifiche per il picco di SARS-CoV-2 e MP_R sono state rilevate nella maggior parte dei casi di COVID-19 nei primi momenti (16 su 17; Fig. 4, H e I e Fig. S5, da A a D). La memoria cT FH sembrava essere stabile, con quasi tutti i soggetti positivi per le cellule cT FH con memoria spike e MP_R a 6 mesi di PSO (rispettivamente 11 su 12 e 10 su 12; Fig. 4, H e I ). Le cellule cT FH attivate di recente sono PD-1 hi ( 57 ). Coerentemente con la conversione in cellule cT FH di memoria a riposo , la percentuale di cT FH di memoria specifica per PD-1 hi SARS-CoV-2 è diminuita nel tempo ( Fig. 4J ). CCR6+ Le cellule FH cT specifiche per SARS-CoV-2 sono state associate a una ridotta gravità della malattia COVID-19 ( 5 ) e in alcuni studi sono state segnalate come una frazione importante delle cellule FH cT specifiche per spike ( 5 , 50 , 58 ) . Qui abbiamo confermato che una frazione significativa di cellule cT FH di memoria sia specifiche per spike che MP_R erano CCR6 + . Abbiamo anche osservato aumenti della memoria CCR6 + cT FH nel tempo ( p = 0,001 e p = 0,014 a ≥6 mesi di PSO rispetto a cT FH di massa , Fig. 4K ). Nel complesso, cT . sostanzialeLa memoria FH è stata osservata dopo l’infezione da SARS-CoV-2, con una durata ≥6 mesi PSO.

Relazioni di memoria immunitaria

È stata considerata la memoria immunitaria per SARS-CoV-2, comprese le relazioni tra i compartimenti della memoria immunitaria. I maschi avevano un picco di IgG più alto [analisi della covarianza (ANCOVA) p = 0.00018, Fig. 5A ] e RBD e IgG nucleocapside (ANCOVA p = 0.00077 e p = 0,018; fig. S6, A e B), coerentemente con altri studi ( 46 , 47 ). Spike IgG più elevate sono state osservate anche nei maschi quando sono stati considerati solo i casi non ospedalizzati (ANCOVA p = 0,00025, fig. S6C). Al contrario, non sono state osservate differenze nei titoli di neutralizzazione di IgA o PSV (fig. S6, da D a F) e non sono state rilevate differenze nella cellula B di memoria SARS-CoV-2, cellula CD8 + T di memoria o CD4 di memoria+ Frequenze delle cellule T tra maschi e femmine (fig. S6, da G a K).
Fig. 5 Relazioni di memoria immunitaria.
A ) Relazione tra genere e titoli di IgG di picco nel tempo. Maschi: modello preferito per il decadimento lineare, 1/2 = 110 giorni; 95% CI: da 65 a 349 giorni, R = -0,27, p = 0,0046. Femmine: modello preferito di decadimento lineare, 1/2 = 159 giorni; 95% CI: da 88 a 846 giorni, R = -0,22, p = 0,016. ANCOVA p = 0.00018. Test per l’omogeneità delle regressioni F = 1,51, p = 0,22. ( B ad E) Memoria immunitaria a 120+ giorni di PSO in soggetti COVID-19 non ospedalizzati e ricoverati. I colori dei simboli rappresentano il picco di gravità della malattia (bianco: asintomatico, grigio: lieve, blu: moderato, rosso: grave). Per i soggetti con più punti temporali di campionamento, per queste analisi è stato utilizzato solo il punto temporale finale. (B) Titoli di legame IgG specifici per il picco (a sinistra) e IgG specifici per RBD (a destra). n = 64 (non ricoverato), n = 10 (ricoverato). Mann-Whitney U test. (C) Frequenza delle cellule B di memoria specifiche per spike (sinistra) e RBD (destra) a 120+ giorni di PSO. n = 66 (non ricoverato), n = 10 (ricoverato). Mann-Whitney U test. (D) Frequenza delle cellule CD8 + T specifiche per SARS-CoV-2 totali (a sinistra) e CD8 + specifiche per il piccoCellule T (a destra). p = 0,72 per SARS-2-CoV-specifico totale, p = 0,60 per spike-specifico secondo Mann-Whitney U test. n = 72 (non ricoverato), n = 10 (ricoverato). (E) Frequenza delle cellule CD4 + T specifiche per SARS-CoV-2 totali (a sinistra) e delle cellule CD4 + T specifiche per il picco (a destra). p = 0,23 per SARS-CoV-2-specifico totale, p = 0,24 per picco specifico dai test U di Mann-Whitney. ( F) Memoria immunitaria a SARS-CoV-2 durante la fase iniziale (da 1 a 2 mesi, linea nera), fase media (da 3 a 4 mesi, linea rossa) o fase tardiva (da 5 a 8 mesi, linea blu). Per ogni individuo, è stato assegnato un punteggio di 1 per ogni risposta al di sopra della LOS per RBD IgG, spike IgA, cellule B di memoria specifiche per RBD, cellule CD4 + T specifiche per SARS-CoV-2 e CD8 specifiche per SARS-CoV-2 + Cellule T, per un totale massimo di cinque componenti della memoria immunitaria SARS-CoV-2. Nell’analisi sono stati inclusi solo i soggetti convalescenti COVID-19 con tutti e cinque i parametri immunologici testati. n = 78 (da 1 a 2 mesi), n = 52 (da 3 a 4 mesi), n = 44 (da 5 a 8 mesi). ( G) Diagrammi a punti percentuali che mostrano le frequenze (normalizzate al 100%) dei soggetti con componenti di memoria immunitaria indicati come descritto in (B) durante la fase precoce (da 1 a 2 mesi) o tardiva (da 5 a 8 mesi). G, IgG specifiche per RBD; B, cellule B di memoria specifiche per RBD; 4, cellule CD4 + T specifiche per SARS-CoV-2 ; 8, cellule CD8 + T specifiche per SARS-CoV-2 ; A, IgA spike-specifiche. n = 78 (da 1 a 2 mesi), n = 44 (da 5 a 8 mesi). ( H) Relazioni tra compartimenti di memoria immunitaria in soggetti COVID-19 nel tempo, come rapporti (curve complete e dati mostrati in fig. S10, da B a F). AU, unità arbitrarie, in scala dalla fig. S10, da B a F; B:IgA, rapporto tra cellule B di memoria specifiche per RBD e spike di anticorpi IgA; B:IgG, rapporto tra cellule B di memoria specifiche per RBD e anticorpi IgG per RBD; B: CD4, rapporto tra cellule B di memoria specifiche per RBD e cellule CD4 + T specifiche per SARS-CoV-2 ; CD4: CD8, rapporto di cellule CD4 + T specifiche per SARS-CoV-2 rispetto a cellule CD8 + T specifiche per SARS-CoV-2 ; Rapporto CD4:IgG, CD4 + T specifici per SARS-CoV-2 e anticorpi IgG RBD.
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La memoria immunitaria è stata esaminata per le associazioni tra l’ampiezza della memoria e la gravità della malattia da COVID-19. Il numero di casi COVID-19 precedentemente ospedalizzati ( n = 13) ha limitato le opzioni di analisi. Tuttavia, i casi erano ben distribuiti tra maschi e femmine ( Tabella 1 ), i dati di un gran numero di casi non ospedalizzati erano disponibili per il confronto e le analisi nelle Figg. da 1 a 4hanno dimostrato che la memoria immunitaria era relativamente stabile nella finestra temporale analizzata. Pertanto, potremmo semplificare l’analisi della gravità della malattia raggruppando tutti i campioni da 120+ giorni di PSO [limitando anche i dati a un singolo campione per soggetto (figg. da S7 a S9); la maggior parte dei soggetti precedentemente ricoverati è stata campionata in due momenti, fig. S7A] e poi confrontando soggetti non ricoverati e ricoverati. I titoli di Spike e RBD IgG nei casi ospedalizzati erano più alti rispetto ai casi non ospedalizzati ( Fig. 5B ), coerentemente con altri studi ( 46 , 47 ). Anche le frequenze delle cellule B di memoria specifiche per Spike e RBD erano più elevate nei casi ospedalizzati (~ 1,7 volte e ~ 2,5 volte, rispettivamente; Fig. 5C e fig. S8). Al contrario, la memoria CD8 +Le frequenze delle cellule T non erano più elevate nei casi ospedalizzati rispetto ai casi non ospedalizzati ( Fig. 5D e Fig. S9) e le frequenze delle cellule CD4 + T di memoria erano più basse nei casi ospedalizzati rispetto ai casi non ospedalizzati ( Fig. 5Ee fig. S9). Pertanto, sebbene le nostre conclusioni siano limitate dal numero di soggetti ospedalizzati, l’aumento dei titoli di IgG a picco era coerente in tre studi indipendenti e qui è stato osservato un aumento delle cellule B di memoria tra i casi ospedalizzati (non misurato in altri studi), indicando che entrambi i compartimenti di lunga durata L’immunità umorale a termine alla SARS-CoV-2 è maggiore negli individui che hanno avuto un decorso più grave della malattia da COVID-19. La memoria delle cellule T non ha seguito lo stesso schema, coerentemente con le indicazioni che i casi ospedalizzati di COVID-19 possono essere associati a risposte delle cellule T più scarse nella fase acuta ( 5 , 59). Inoltre, questi dati mostrano che, sebbene il genere e la gravità della malattia COVID-19 contribuiscano alle differenze nella memoria immunitaria per SARS-CoV-2, nessuno dei due fattori potrebbe spiegare la maggior parte dell’eterogeneità nella memoria immunitaria per questo virus.
Pochissimi set di dati pubblicati confrontano l’anticorpo specifico dell’antigene, le cellule B, le cellule CD8 + T e la memoria delle cellule CD4 + T con un’infezione virale acuta negli stessi individui. Abbiamo quindi utilizzato questo set di dati combinato per esaminare le interrelazioni tra i compartimenti della memoria immunitaria. Ci siamo concentrati su RBD IgG, cellule B di memoria RBD, spike IgA, cellule CD8 + T specifiche per SARS-CoV-2 totali e cellule CD4 + T specifiche per SARS-CoV-2 totali , a causa dei loro potenziali ruoli potenziali nell’immunità protettiva . La maggior parte (64%) dei casi di COVID-19 era positiva per tutti e cinque questi compartimenti di memoria immunitaria a 1 o 2 mesi di PSO ( Fig. 5, F e G ), con le risposte incomplete che riflettevano in gran parte individui senza CD8 + rilevabili .Memoria delle cellule T e/o scarse risposte IgA ( Fig. 5G ). Da 5 a 8 mesi dopo l’infezione da COVID-19, la percentuale di individui positivi per tutti e cinque questi compartimenti di memoria immunitaria era scesa al 43%; tuttavia, il 95% degli individui era ancora positivo per almeno tre su cinque risposte di memoria immunitaria SARS-CoV-2 ( Fig. 5G ). La memoria immunitaria da 5 a 8 mesi PSO rappresentava contributi da diversi compartimenti di memoria immunitaria in individui differenti ( Fig. 5G ). Risultati simili sono stati ottenuti se RBD IgG è stato sostituito da anticorpi neutralizzanti (fig. S10A). Nel complesso, questi risultati evidenziano ancora una volta l’eterogeneità della memoria immunitaria, con diversi modelli di memoria immunitaria in individui diversi.
Le interrelazioni tra i componenti della memoria sono state successivamente esaminate valutando i rapporti tra i compartimenti della memoria immunitaria nel tempo. Il rapporto tra la memoria delle cellule SARS-CoV-2 CD4 + T e la memoria delle cellule SARS-CoV-2 CD8 + T era ampiamente stabile nel tempo ( Fig. 5H e Fig. S10B). Dato che le misurazioni sierologiche sono le misurazioni più semplici della memoria immunitaria su scala di popolazione, abbiamo esaminato quanto bene tali misurazioni sierologiche possano servire come marcatori surrogati di altri componenti della memoria immunitaria SARS-CoV-2 nel tempo. La relazione tra le IgG RBD circolanti e le cellule B di memoria specifiche per RBD è cambiata di circa 20 volte nell’intervallo di tempo studiato ( R = 0,60, Fig. 5He fig. S10C). La relazione mutevole tra le IgA di picco circolanti e le cellule B di memoria specifiche per RBD era ancora maggiore ( R = 0,55, Fig. 5H e Fig. S10D). La relazione tra RBD IgG e SARS-CoV-2 CD4 + memoria delle cellule T era relativamente piatta nell’intervallo di tempo studiato ( Fig. 5H ); tuttavia, la variazione ha abbracciato un intervallo di ~1000 volte (fig. S10E). Pertanto, il potere predittivo delle IgG RBD circolanti per la valutazione della memoria delle cellule T era scarso a causa dell’eterogeneità tra gli individui ( R = 0,046). In sintesi, sebbene l’eterogeneità delle risposte immunitarie sia una caratteristica distintiva di COVID-19, la memoria immunitaria a SARS-CoV-2 si sviluppa in quasi tutti i soggetti, con relazioni complesse tra i singoli compartimenti di memoria immunitaria.

Osservazioni conclusive

In this study, we aimed to fill gaps in our basic understanding of immune memory after COVID-19. This required simultaneous measurement of circulating antibodies, memory B cells, CD8+ T cells, and CD4+ T cells specific for SARS-CoV-2, in a group of subjects with a full range of disease, and distributed from short time points after infection to 8 months later. By studying these multiple compartments of adaptive immunity in an integrated manner, we observed that each component of SARS-CoV-2 immune memory exhibited distinct kinetics.
I titoli di picco di IgG erano durevoli, con modeste diminuzioni dei titoli a 6-8 mesi di PSO a livello di popolazione. I titoli anticorpali neutralizzanti RBD IgG e SARS-CoV-2 PSV erano potenzialmente altrettanto stabili, in linea con il fatto che il dominio RBD dello spike era il bersaglio anticorpale neutralizzante dominante. Abbiamo raccolto dati in due momenti per la maggior parte degli individui longitudinali qui. È ben noto che l’entità della risposta anticorpale contro SARS-CoV-2 è altamente eterogenea tra gli individui. Abbiamo osservato che le risposte anticorpali iniziali eterogenee non collassavano in una memoria anticorpale circolante omogenea; piuttosto, l’eterogeneità è anche una caratteristica centrale della memoria immunitaria per questo virus. Per gli anticorpi, le risposte hanno abbracciato un intervallo di circa 200 volte. Inoltre, questa eterogeneità significa che saranno necessari studi longitudinali a lungo termine per definire con precisione la cinetica anticorpale per SARS-CoV-2. Riportiamo i modelli statistici più semplici che spiegano i dati. Questi adattamenti della curva non confutano cinetiche più complesse come la cinetica sovrapposta, ma quei modelli richiederebbero un campionamento longitudinale molto più denso negli studi futuri. Biologicamente, gli anticorpi IgG con un’emivita di ~ 21 giorni e l’entità della risposta anticorpale nel tempo, riflettono gli anticorpi prodotti prima dalle plasmacellule a vita breve e poi dalle plasmacellule a vita lunga, con la maturazione dell’affinità che influenza anche l’entità apparente in saggi di legame convenzionali e saggi di neutralizzazione. Complessivamente, a 5-8 mesi di PSO, quasi tutti gli individui erano positivi per SARS-CoV-2 spike e RBD IgG. Riportiamo i modelli statistici più semplici che spiegano i dati. Questi adattamenti della curva non confutano cinetiche più complesse come la cinetica sovrapposta, ma quei modelli richiederebbero un campionamento longitudinale molto più denso negli studi futuri. Biologicamente, gli anticorpi IgG con un’emivita di ~ 21 giorni e l’entità della risposta anticorpale nel tempo, riflettono gli anticorpi prodotti prima dalle plasmacellule a vita breve e poi dalle plasmacellule a vita lunga, con la maturazione dell’affinità che influenza anche l’entità apparente in saggi di legame convenzionali e saggi di neutralizzazione. Complessivamente, a 5-8 mesi di PSO, quasi tutti gli individui erano positivi per SARS-CoV-2 spike e RBD IgG. Riportiamo i modelli statistici più semplici che spiegano i dati. Questi adattamenti della curva non confutano cinetiche più complesse come la cinetica sovrapposta, ma quei modelli richiederebbero un campionamento longitudinale molto più denso negli studi futuri. Biologicamente, gli anticorpi IgG con un’emivita di ~ 21 giorni e l’entità della risposta anticorpale nel tempo, riflettono gli anticorpi prodotti prima dalle plasmacellule a vita breve e poi dalle plasmacellule a vita lunga, con la maturazione dell’affinità che influenza anche l’entità apparente in saggi di legame convenzionali e saggi di neutralizzazione. Complessivamente, a 5-8 mesi di PSO, quasi tutti gli individui erano positivi per SARS-CoV-2 spike e RBD IgG. ma quei modelli richiederebbero un campionamento longitudinale molto più denso negli studi futuri. Biologicamente, gli anticorpi IgG con un’emivita di ~ 21 giorni e l’entità della risposta anticorpale nel tempo, riflettono gli anticorpi prodotti prima dalle plasmacellule a vita breve e poi dalle plasmacellule a vita lunga, con la maturazione dell’affinità che influenza anche l’entità apparente in saggi di legame convenzionali e saggi di neutralizzazione. Complessivamente, a 5-8 mesi di PSO, quasi tutti gli individui erano positivi per SARS-CoV-2 spike e RBD IgG. ma quei modelli richiederebbero un campionamento longitudinale molto più denso negli studi futuri. Biologicamente, gli anticorpi IgG con un’emivita di ~ 21 giorni e l’entità della risposta anticorpale nel tempo, riflettono gli anticorpi prodotti prima dalle plasmacellule a vita breve e poi dalle plasmacellule a vita lunga, con la maturazione dell’affinità che influenza anche l’entità apparente in saggi di legame convenzionali e saggi di neutralizzazione. Complessivamente, a 5-8 mesi di PSO, quasi tutti gli individui erano positivi per SARS-CoV-2 spike e RBD IgG. con maturazione dell’affinità influenzando anche l’entità apparente nei saggi di legame convenzionali e nei saggi di neutralizzazione. Complessivamente, a 5-8 mesi di PSO, quasi tutti gli individui erano positivi per SARS-CoV-2 spike e RBD IgG. con maturazione dell’affinità influenzando anche l’entità apparente nei saggi di legame convenzionali e nei saggi di neutralizzazione. Complessivamente, a 5-8 mesi di PSO, quasi tutti gli individui erano positivi per SARS-CoV-2 spike e RBD IgG.
In particolare, le cellule B di memoria specifiche per la proteina spike o RBD sono state rilevate in quasi tutti i casi di COVID-19, senza emivita apparente da 5 a 8 mesi dopo l’infezione. Altri studi sulle cellule B della memoria RBD riportano risultati simili ( 50 , 60 ). È stato osservato che la memoria delle cellule B per alcune altre infezioni è di lunga durata, compresi 60+ anni dopo la vaccinazione contro il vaiolo ( 61 ) o 90+ anni dopo l’infezione con l’influenza ( 62 ). Le emivite delle cellule T di memoria osservate in oltre 6 mesi di PSO in questa coorte (da ~125 a 225 giorni per le cellule CD8 + e da ~94 a 153 giorni per le cellule T CD4 + ) erano paragonabili ai 123 giorni t1/ 2 osservate per la memoria CD8 +Cellule T dopo immunizzazione contro la febbre gialla ( 56 ). Anche la memoria delle cellule T SARS-CoV-2 a 6 mesi è stata riportata in un altro studio ( 63 ). In particolare, la durata di una frazione delle cellule CD8 + T di memoria specifiche del virus della febbre gialla possedeva una 1/2 stimata di 485 giorni mediante etichettatura del deuterio ( 56 ). Utilizzando approcci diversi, gli studi hanno determinato che la durata a lungo termine delle cellule di memoria CD4 + T contro il vaiolo, per un periodo di molti anni, è stimata in 1/2 di ~ 10 anni ( 61 , 64), che è anche coerente con il recente rilevamento di cellule T specifiche per SARS-CoV 17 anni dopo l’infezione iniziale ( 65 ). Questi dati suggeriscono che la memoria delle cellule T potrebbe raggiungere un plateau più stabile, o una fase di decadimento più lenta, oltre i primi 8 mesi dopo l’infezione.
Sebbene la memoria immunitaria sia la fonte dell’immunità protettiva a lungo termine, non è possibile trarre conclusioni dirette sull’immunità protettiva sulla base della quantificazione degli anticorpi circolanti SARS-CoV-2, delle cellule B della memoria, delle cellule T CD8 + e delle cellule T CD4 + , perché meccanismi di immunità protettiva contro SARS-CoV-2 o COVID-19 non sono definiti negli esseri umani. Tuttavia, si possono fare alcune ragionevoli interpretazioni. Gli anticorpi sono l’unico componente della memoria immunitaria in grado di fornire un’immunità veramente sterilizzante. Studi di immunizzazione in primati non umani hanno indicato che titoli di neutralizzazione circolanti di ~200 possono fornire un’immunità sterilizzante contro un challenge URT a dosi relativamente elevate ( 66), e titoli neutralizzanti di ~ 3400 possono fornire un’immunità sterilizzante contro un test URT a dose molto elevata ( 67 ), sebbene i confronti diretti non siano possibili perché i test degli anticorpi neutralizzanti non sono stati standardizzati ( 3 ). Le conclusioni sono anche limitate dalla quantità complessiva limitata di dati sull’immunità protettiva alla SARS-CoV-2.
Oltre a sterilizzare l’immunità, le risposte immunitarie che confinano SARS-CoV-2 all’URT e alla cavità orale minimizzerebbero la gravità della malattia COVID-19 a quella di un “raffreddore comune” o di una malattia asintomatica. Questo risultato è l’obiettivo principale degli attuali studi clinici sui vaccini COVID-19 ( 3 , 68 ). Tale risultato potrebbe essere potenzialmente mediato da una miscela di cellule T CD4 + di memoria, cellule T CD8 + di memoria e cellule B di memoria specifiche per anticorpi neutralizzanti anamnestici che producono RBD, sulla base di meccanismi d’azione in modelli murini di altre infezioni virali ( 69 – 71 ). Nelle infezioni umane da COVID-19, cellule CD4 + T specifiche per SARS-CoV-2 e CD8 +Le cellule T sono associate a una minore gravità della malattia COVID-19 durante un’infezione da SARS-CoV-2 in corso ( 5 ). La rapida sieroconversione è stata associata a cariche virali sostanzialmente ridotte nella malattia acuta nell’arco di 14 giorni ( 29). Entrambe queste associazioni sono coerenti con l’ipotesi che le cellule T e B di memoria SARS-CoV-2 sarebbero in grado di limitare sostanzialmente la diffusione di SARS-CoV-2 e/o la carica virale cumulativa, con conseguente riduzione della gravità della malattia da COVID-19. La probabilità di tali esiti è anche strettamente legata alla cinetica dell’infezione, poiché le risposte delle cellule B e T della memoria possono richiedere da 3 a 5 giorni per rispondere con successo a un’infezione. Come notato sopra, dato il decorso relativamente lento del COVID-19 grave nell’uomo, i compartimenti di memoria immunitaria a riposo possono potenzialmente contribuire in modo significativo all’immunità protettiva contro la polmonite o il COVID-19 secondario grave. La presenza di titoli anticorpali neutralizzanti sottosterilizzanti al momento dell’esposizione a SARS-CoV-2 ridurrebbe le dimensioni dell’infezione iniziale,37 , 72 – 74 ) e le osservazioni di SARS-CoV-2 vaccini in primati non umani ( 48 , 67 , 75 ).
Lo studio attuale presenta alcune limitazioni. Per una comprensione più precisa della cinetica di durata degli anticorpi specifici per SARS-CoV-2 sarebbero necessari dati longitudinali per ciascun soggetto, con almeno tre punti temporali per soggetto. Tuttavia, gli attuali dati trasversali descrivono bene le dinamiche delle cellule B di memoria SARS-CoV-2, delle cellule CD8 + T e delle cellule T CD4 + in 8 mesi di PSO. Questo studio non era sufficientemente potente per controllare molte variabili contemporaneamente. Inoltre, qui è stata valutata la memoria circolante; è possibile che la memoria immunitaria URT locale sia una componente minima, moderata o grande della memoria immunitaria dopo un’infezione primaria da SARS-CoV-2. Questo resta da determinare.
Segnalazioni di casi individuali mostrano che si stanno verificando reinfezioni da SARS-CoV-2 ( 76 , 77 ). Tuttavia, uno studio su 2800 persone non ha riscontrato re-infezioni sintomatiche in una finestra di ~118 giorni ( 78 ), e uno studio su 1246 persone non ha osservato re-infezioni sintomatiche in 6 mesi ( 79). Abbiamo osservato l’eterogeneità nell’entità delle risposte immunitarie adattative a SARS-CoV-2 che persiste nella fase di memoria immunitaria. È quindi possibile che una frazione della popolazione infetta da SARS-CoV-2 con bassa memoria immunitaria diventi suscettibile alla reinfezione in tempi relativamente brevi. Sebbene il genere e la gravità della malattia contribuiscano entrambi all’eterogeneità della memoria immunitaria qui riportata, la fonte di gran parte dell’eterogeneità nella memoria immunitaria per SARS-CoV-2 è sconosciuta e merita un ulteriore esame. Forse l’eterogeneità deriva da una bassa carica virale cumulativa o da un piccolo inoculo iniziale in alcuni individui. Tuttavia, i nostri dati mostrano che la memoria immunitaria in almeno tre compartimenti immunologici era misurabile in circa il 95% dei soggetti da 5 a 8 mesi di PSO,

Materiali e metodi

Soggetti umani

Gli Institutional Review Board dell’Università della California, San Diego (UCSD; 200236X) e il La Jolla Institute for Immunology (LJI; VD-214) hanno approvato i protocolli utilizzati per la raccolta del sangue per i soggetti con COVID-19 che hanno donato in tutti i siti diversi rispetto al monte Sinai. La Icahn School of Medicine at Mount Sinai IRB ha approvato i campioni raccolti presso questa istituzione a New York City (IRB-16-00791). Tutti i soggetti umani sono stati valutati per la capacità decisionale medica utilizzando una valutazione standardizzata e approvata e hanno dato volontariamente il consenso informato prima di essere arruolati nello studio. I criteri di inclusione dello studio includevano una diagnosi di COVID-19 o sospetto COVID-19, età pari o superiore a 18 anni e volontà e capacità di fornire il consenso informato. Sebbene non sia un criterio di inclusione rigoroso, prove di test positivi basati sulla reazione a catena della polimerasi (PCR) per SARS-CoV-2 sono state richieste ai soggetti prima della partecipazione. Un totale di 145 casi è stato confermato SARS-CoV-2 positivo da test basati su PCR (Tabella 1 ). Due soggetti sono risultati negativi alla PCR SARS-CoV-2 ( Tabella 1 ). Il resto non è stato testato o non aveva risultati del test disponibili per la revisione ( Tabella 1). Sono stati quindi esclusi i soggetti che avevano una storia medica e/o sintomi coerenti con COVID-19, ma non avevano test positivi basati su PCR per SARS-CoV-2 e successivamente avevano test sierologici di laboratorio negativi per SARS-CoV-2; cioè, tutti i casi di COVID-19 in questo studio sono stati confermati da SARS-CoV-2 PCR o sierodiagnostica SARS-CoV-2, o entrambi. Erano ammessi a partecipare adulti di tutte le razze, etnie, età e sesso. I criteri di esclusione dallo studio includevano la mancanza di volontà di partecipare, la mancanza di capacità di fornire il consenso informato o una controindicazione medica alla donazione di sangue (p. es., grave anemia). I campioni dei soggetti a LJI sono stati ottenuti da individui in California e in almeno altri sette stati.
I metodi di raccolta e trattamento del sangue presso LJI sono stati eseguiti come descritto in precedenza ( 5 ). In breve, il sangue intero è stato raccolto tramite flebotomia in provette con separatore di siero acido citrato destrosio (ACD) (SST) o acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) e trattato per l’isolamento di cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC), siero e plasma. La maggior parte dei donatori è stata sottoposta a screening per i sintomi prima di programmare i prelievi di sangue e doveva essere asintomatica e a circa 3-4 settimane dall’insorgenza dei sintomi al momento del prelievo di sangue iniziale a UCSD o LJI, rispettivamente. I campioni sono stati codificati e quindi deidentificati prima dell’analisi. Altri sforzi per mantenere la riservatezza dei partecipanti includevano i campioni di etichettatura con numeri di identificazione codificati. Una panoramica delle caratteristiche dei soggetti con COVID-19 è fornita inTabella 1 .
La gravità della malattia COVID-19 è stata valutata da 0 a 10 utilizzando un sistema di punteggio numerico basato sulla scala ordinale NIH ( 5 , 80 ). È stato applicato un descrittore categorico basato su questo sistema di punteggio: “asintomatico” per un punteggio di 1, “lieve” per un punteggio da 2 a 3, “moderato” per un punteggio da 4 a 5 e “grave” per un punteggio di 6 o più. I soggetti con un punteggio numerico di 4 o superiore hanno richiesto il ricovero ospedaliero (incluso il ricovero per osservazione) per la gestione del COVID-19. Solo uno dei 13 soggetti ricoverati è condiviso dal precedente studio di COVID-19 acuto ( 5). I giorni di PSO sono stati determinati in base alla differenza tra la data del prelievo di sangue e la data dei primi sintomi segnalati coerenti con COVID-19. Per i soggetti asintomatici, è stato utilizzato il giorno del primo test positivo basato sulla PCR SARS-CoV-2 al posto della data dei primi sintomi di COVID-19 segnalati.

Proteine ​​ricombinanti

La proteina spike stabilizzata [2P ( 81 )] e l’RBD sono stati espressi nelle cellule HEK293F. In breve, il DNA che esprime la proteina spike stabilizzata e l’RBD sono stati subclonati in vettori phCMV separati e trasfettati in cellule HEK293F con un rapporto di 1 mg di DNA per 1 litro di cellule. Le cellule sono state coltivate a 37°C in un agitatore incubatore impostato a 125 rpm, 80% di umidità e 8% di CO 2. Quando la vitalità cellulare è scesa al di sotto dell’80% (in genere da 4 a 5 giorni), i terreni sono stati raccolti e centrifugati per rimuovere le cellule. Il reagente Biolock è stato aggiunto al mezzo surnatante per rimuovere l’eventuale biotina in eccesso. Il mezzo è stato quindi filtrato attraverso un filtro da 0,22 µm per rimuovere gli aggregati Biolocked. Le proteine ​​sono state purificate utilizzando colonne Streptrap HP 5 ml (Cytiva) utilizzando 100 mM Tris, 100 mM NaCl come tampone di lavaggio e 100 mM Tris, 100 mM NaCl, 2,5 mM d-Destiobiotina come tampone di eluizione. Le frazioni eluite per le proteine ​​spike sono state concentrate su filtri Amicon da 100 kDa e gli RBD sono stati concentrati su filtri da 10 kDa. I campioni sono stati ulteriormente purificati utilizzando le colonne S6increase per le varianti spike e la colonna S200increase per l’RBD.

ELISA SARS-CoV-2

Gli ELISA SARS-CoV-2 sono stati eseguiti come descritto in precedenza ( 2 , 5 , 82). In breve, le piastre Corning da 96 pozzetti (ThermoFisher 3690) sono state rivestite con 1 μg/ml di antigene durante la notte a 4°C. Gli antigeni includevano la proteina RBD SARS-CoV-2 ricombinante, la proteina spike ricombinante e la proteina nucleocapside ricombinante (GenScript Z03488) [antigeni nucleocapside ricombinanti sono stati testati anche da Sino Biological (40588-V07E) e Invivogen (his-sars2-n) e hanno prodotto risultati comparabili risultati al nucleocapside GenScript]. Il giorno successivo, le piastre sono state bloccate con latte al 3% in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) contenente Tween-20 allo 0,05% per 1,5 ore a temperatura ambiente. Il plasma è stato inattivato al calore a 56°C per 30-60 min. Il plasma è stato diluito in latte all’1% contenente Tween-20 allo 0,05% in PBS partendo da una diluizione 1:3 seguita da diluizioni seriali per tre e incubato per 1,5 ore a temperatura ambiente. Le piastre sono state lavate cinque volte con 0. 05% PBS-Tween-20. Gli anticorpi secondari sono stati diluiti in latte all’1% contenente lo 0,05% di Tween-20 in PBS. Per le IgG, è stato utilizzato l’anticorpo anti perossidasi IgG umane prodotto in capra (Sigma A6029) a una diluizione 1:5.000. Per le IgA, è stato utilizzato un anticorpo anti-IgA umano perossidasi di rafano (Hybridoma Reagent Laboratory HP6123-HRP) a una diluizione 1:1.000. L’anti-IgA monoclonale HP6123 è stato utilizzato per la sua specificità convalidata dai CDC e dall’OMS per IgA1 e IgA2 umane e per la mancanza di cross-reattività con isotipi non IgA (83 ).
I titoli degli end-point sono stati tracciati per ciascun campione, utilizzando i dati sottratti dal background. Sono stati utilizzati controlli negativi e positivi per standardizzare ciascun dosaggio e normalizzare tra gli esperimenti. È stato creato uno standard di controllo positivo riunendo il plasma di sei donatori convalescenti di COVID-19 per normalizzare tra gli esperimenti. Il limite di rilevazione (LOD) è stato definito come 1:3 per IgG, 1:10 per IgA. Il limite di sensibilità (LOS) per gli individui infetti da SARS-CoV-2 è stato stabilito sulla base di soggetti non infetti, utilizzando plasma proveniente da donatori sani normali mai esposti a SARS-CoV-2. Per le analisi trasversali, è stata eseguita la modellazione per la curva di adattamento migliore (ad esempio, un decadimento di fase rispetto alla semplice regressione lineare) utilizzando GraphPad Prism 8.0. Il miglior adattamento della curva è stato definito da un test F extra della somma dei quadrati, selezionando il modello più semplice a meno che P< 0,05 ( 84 ). Il decadimento continuo (regressione lineare), il decadimento a una fase o il decadimento a due fasi dei dati di log sono stati valutati in tutti i casi, con il modello statistico più appropriato scelto sulla base del test F; in molti casi è stato considerato anche un fit di equazioni quadratiche. Per calcolare il 1/2 , log 2 dati -transformed sono stati utilizzati. Utilizzando la curva di miglior adattamento, è stato utilizzato un adattamento non lineare del decadimento a una fase o una semplice regressione lineare (decadimento continuo). Per semplici regressioni lineari, R di Pearson è stato calcolato per la correlazione utilizzando dati trasformati in log 2 . Per l’adattamento non lineare del decadimento a una fase, Rè stato riportato. Per i campioni longitudinali, è stata eseguita una semplice regressione lineare, con 1/2 calcolato dai dati trasformati in log 2 per ciascuna coppia. Per le analisi di genere, la modellazione e 1/2 sono state eseguite in modo simile alle analisi trasversali; ANCOVA (VassarStats o GraphPad Prism 8.4) è stato quindi eseguito tra set di dati maschili e femminili. ANCOVA p- value delle medie aggiustate sono stati riportati e considerati significativi se il test per l’omogeneità delle regressioni non era significativo.

Saggi di anticorpi neutralizzanti

Il saggio dell’anticorpo neutralizzante lo pseudovirus è stato eseguito come descritto in precedenza ( 5 ). In breve, le cellule Vero sono state seminate in piastre da 96 pozzetti per produrre un monostrato al momento dell’infezione. Quantità pretitolate di rVSV-SARS-Cov-2 [phCMV3-SARS-CoV-2 spike SARS-CoV-2-pseduotipizzato VSV-ΔG-GFP (proteina fluorescente verde) sono state generate trasfettando cellule HEK293T, ATCC CRL-3216] sono state incubate con plasma umano diluito in serie a 37 ° C per 1 ora prima dell’aggiunta a monostrati di cellule Vero confluenti (ATCC CCL-81) in piastre da 96 pozzetti. Le cellule sono state incubate per 12-16 ore a 37°C in 5% CO2 .Le cellule sono state quindi fissate in paraformaldeide al 4%, colorate con 1 μg/ml di Hoechst e riprese con un imager CellInsight CX5 per quantificare il numero totale di cellule che esprimono GFP. L’infezione è stata normalizzata al numero medio di cellule infettate da rVSV-SARS-CoV-2 incubate con plasma umano normale. Il LOD è stato stabilito come <1:20 sulla base di campioni di plasma provenienti da una serie di soggetti di controllo non esposti. I segnali negativi sono stati impostati su 1:19. Neutralizzazione IC 50 (mediana concentrazione inibente) titoli sono stati calcolati utilizzando One-Site Fit LogIC50 regressione GraphPad Prism 8.0.

Rilevamento di cellule B di memoria antigene-specifiche

Per rilevare le cellule B specifiche per SARS-CoV-2, gli antigeni proteici biotinilati sono stati multimerizzati individualmente con streptavidina marcata in modo fluorescente a 4°C per 1 ora. Il picco di SARS-CoV-2 a tutta lunghezza (stabilizzato da 2P, doppia etichetta con Strep) e RBD sono stati generati internamente. La biotinilazione è stata eseguita utilizzando il kit di reazione standard della biotina-proteina ligasi (Avidity, catalogo n. Bir500A) seguendo il protocollo standard del produttore e dializzato durante la notte contro PBS. Lo spike biotinilato è stato miscelato con streptavidina BV421 (BioLegend, n. di catalogo 405225) e streptavidina Alexa Fluor 647 (Thermo Fisher Scientific, n. di catalogo S21374) con un rapporto 20:1 (~6:1 rapporto molare). Il RBD biotinilato è stato miscelato con streptavidina ficoeritrina (PE)/Cyanine7 (BioLegend, n. di catalogo 405206) in un rapporto di 2,2:1 (rapporto molare di ~4:1). Nucleocapside biotinilato SARS-CoV-2 a lunghezza intera (con tag Avi e His; Sino Biological, catalogo n. 40588-V27B-B) è stato multimerizzato utilizzando streptavidina PE (BioLegend, n. di catalogo 405204) e streptavidina BV711 (BioLegend, n. di catalogo 405241) con un rapporto 5,5:1 (~6:1 rapporto molare). Streptavidina PE/Cyanine5.5 (Thermo Fisher Scientific, catalogo n. SA1018) è stata utilizzata come sonda esca per eliminare le cellule B non specifiche che legano la streptavidina SARS-CoV-2. Le sonde antigene preparate singolarmente come sopra sono state quindi miscelate in Brilliant Buffer (BD Bioscience, n. di catalogo 566349) contenente 5 μM di d-biotina libera (Avidity, n. di catalogo Bir500A). La d-biotina libera ha garantito una reattività crociata minima delle sonde dell’antigene. Circa 10 5 (Thermo Fisher Scientific, catalogo n. SA1018) è stato utilizzato come sonda esca per escludere le cellule B non specifiche che legano la streptavidina SARS-CoV-2. Le sonde antigene preparate singolarmente come sopra sono state quindi miscelate in Brilliant Buffer (BD Bioscience, n. di catalogo 566349) contenente 5 μM di d-biotina libera (Avidity, n. di catalogo Bir500A). La d-biotina libera ha garantito una reattività crociata minima delle sonde dell’antigene. Circa 10 5 (Thermo Fisher Scientific, catalogo n. SA1018) è stato utilizzato come sonda esca per escludere le cellule B non specifiche che legano la streptavidina SARS-CoV-2. Le sonde antigene preparate singolarmente come sopra sono state quindi miscelate in Brilliant Buffer (BD Bioscience, n. di catalogo 566349) contenente 5 μM di d-biotina libera (Avidity, n. di catalogo Bir500A). La d-biotina libera ha garantito una reattività crociata minima delle sonde dell’antigene. Circa 107 campioni di PBMC precedentemente congelati sono stati preparati in piastre da 96 pozzetti con fondo a U e colorati con 50 µl di cocktail di sonde antigeniche contenente 100 ng di spike per sonda (totale 200 ng), 27,5 ng di RBD, 40 ng di nucleocapside per sonda (totale 80 ng) e 20 ng di streptavidina PE/Cyanine5.5 a 4°C per 1 ora per garantire la massima qualità di colorazione prima che la colorazione superficiale con anticorpi come elencato nella tabella S1 sia eseguita in Brilliant Buffer a 4°C per 30 min. Le cellule morte sono state colorate utilizzando LIVE/DEAD Fixable Blue Stain Kit (Thermo Fisher Scientific, n. di catalogo L34962) in DPBS a 4°C per 30 min. Circa l’80% delle cellule B della memoria antigene-specifica (IgD  e/o CD27 + ) rilevate utilizzando questo metodo erano IgM + , IgG + o IgM  IgG IgA + , che erano paragonabili alle cellule B di memoria non specifiche. Sulla base di queste osservazioni, abbiamo concluso che le sonde dell’antigene non hanno influito sostanzialmente sulla qualità della colorazione delle immunoglobuline di superficie. I campioni di PBMC colorati sono stati acquisiti su Cytek Aurora e analizzati utilizzando FlowJo10.7.1 (BD Bioscience).
La frequenza delle cellule B di memoria antigene-specifiche è stata espressa come percentuale delle cellule B totali (CD19 + CD20 + CD38 int/– , CD3  , CD14  , CD16  , CD56  , LIVE/DEAD  , linfociti), o come numero per 10 6 PBMC (LIVE/DEAD  cellule). LOD è stato impostato sulla base della mediana + 2 × deviazione standard (DS) di [1/(numero di cellule B totali registrate)] o della mediana + 2 × SD di [10 6/(numero di PBMC registrati)]. La LOS è stata impostata come mediana + 2 × SD dei risultati in donatori non esposti. L’analisi del fenotipo delle cellule B antigene-specifiche è stata eseguita solo in soggetti con almeno 10 cellule rilevate nella rispettiva porta delle cellule B di memoria antigene-specifica. In ogni esperimento, sono stati inclusi PBMC da un controllo positivo noto (soggetto convalescente COVID-19) e soggetti non esposti per garantire una sensibilità e una specificità coerenti del test. Per ogni set di dati sono stati considerati modelli cinetici polinomiali di secondo ordine, regressione lineare semplice e pseudo-primo ordine. Il modello con un valore del criterio di informazione di Akaike più basso è stato determinato per essere un adattamento migliore e visualizzato.

Analisi delle cellule T dei marcatori indotti dall’attivazione (AIM)

Le cellule T CD4 + antigene-specifiche sono state misurate come percentuale di cellule AIM + (OX40 + CD137 + ) CD4 + T e (CD69 + CD137 + ) CD8 + T dopo stimolazione di PBMC con megapool di peptidi (MP) sovrapposti che coprono l’intera SARS -CoV-2 ORFeome, come precedentemente descritto ( 2 ). Le cellule sono state coltivate per 24 ore in presenza di MP specifici per SARS-CoV-2 (1 μg/ml) o 5 μg/ml di fitoemoagglutinina (PHA, Roche) in piastre con fondo a U da 96 pozzetti a 1 × 10 6 PBMC per bene. La stimolazione con una quantità equimolare di dimetilsolfossido (DMSO) è stata eseguita come controllo negativo. PHA e stimolazione con un CD4 . combinato+ e CD8 + epitopo MP del citomegalovirus (CMV, 1 μg/ml) sono stati inclusi come controlli positivi. Qualsiasi campione con un segnale PHA basso è stato escluso come controllo di qualità.
Le cellule T CD4 + e CD8 + antigene-specifiche sono state misurate come dati sottratti di sfondo (DMSO), con un livello minimo di DMSO impostato su 0,005%. Tutti gli ORF positivi (>0,02% per CD4 + , >0,05% per CD8 + ) sono stati quindi aggregati in una somma combinata di cellule CD4 + o CD8 + specifiche per SARS-CoV-2 . La soglia di positività per le risposte delle cellule CD4 + T antigene-specifiche (0,03%) e le risposte delle cellule T CD8 + antigene-specifiche (0,12%) è stata calcolata utilizzando la doppia deviazione standard mediana di tutti i controlli negativi misurati (>150). Il pannello di anticorpi utilizzato nel (OX40 + CD137 + ) CD4 +T e (CD69 + CD137 + ) CD8 + cellule T La colorazione AIM è mostrata nella tabella S2. È stata eseguita un’analisi di coerenza per misurazioni multiple dei test delle cellule T AIM da due diversi operatori. Prima della fusione, abbiamo confrontato l’immunodominanza proteica, le risposte totali delle cellule T CD4 + e CD8 + specifiche per SARS-CoV-2 e i calcoli dell’emivita tra i due gruppi di dati sperimentali. Nelle analisi longitudinali, i calcoli dell’emivita hanno escluso tutti i campioni negativi in ​​entrambi i momenti (perché non è stato possibile calcolare un’emivita), sebbene tutti i dati siano stati inclusi nei grafici.
Per i saggi AIM di superficie CD40L + OX40 + CD4 + cellule T, gli esperimenti sono stati eseguiti come descritto in precedenza ( 5 ), con le seguenti modifiche. Le cellule sono state coltivate in RPMI completo contenente siero AB umano al 5% (Gemini Bioproducts), -mercaptoetanolo, penicillina/streptomicina, piruvato di sodio (NaPy) e amminoacidi non essenziali. Prima dell’aggiunta di MP peptidici, le cellule sono state bloccate a 37 ° C per 15 minuti con 0,5 μg/ml di mAb anti-CD40 (Miltenyi Biotec). È stata eseguita una stimolazione con una quantità equimolare di DMSO per determinare la sottrazione del fondo e l’attivazione da enterotossina stafilococcica B (SEB) a 1 μg/ml è stata utilizzata come controllo di qualità (positivo). LOD per cT FH antigene-specifico tra CD4 +Le cellule T si basavano sul LOD per le cellule CD4 + T antigene-specifiche (descritte sopra) moltiplicato per la % media di cT FH nelle cellule T CD4 di massa tra i campioni di controllo. Una soglia di inclusione di dieci eventi dopo il gate cT FH CXCR5 + è stata utilizzata per i calcoli di PD-1 hi e CCR6 + e per i rispettivi confronti sono stati applicati i test statistici non parametrici di Mann-Whitney e Wilcoxon.

Ringraziamenti

Ringraziamo il LJI Clinical Core, in particolare G. Levi e B. Schwan per l’iscrizione di donatori sani e l’approvvigionamento di campioni di sangue. Ringraziamo C. Moderbacher per l’input sull’analisi dei dati. Siamo anche grati all’Iniziativa di virologia personalizzata del Monte Sinai per aver condiviso campioni raccolti dai partecipanti allo studio con COVID-19. Siamo grati ad A. Wajnberg per le segnalazioni dei partecipanti allo studio e alla Personalized Virology Initiative (G. Kleiner, LCF Mulder, M. Saksena, K. Srivastava, C. Gleason, CM Bermúdez-González, K. Beach, K. Russo, L. Sominsky, E. Ferreri, R. Chernet, L. Eaker, A. Salimbangon, D. Jurczyszak, H. Alshammary, W. Mendez, A. Amoako, S. Fabre, S. Suthakaran, M. Awawda, E. Hirsch, A. Shin) per aver condiviso campioni in banca di partecipanti allo studio con COVID-19. Finanziamento:Questo lavoro è stato finanziato dal NIH NIAID nell’ambito dei premi AI142742 (Centri cooperativi per l’immunologia umana) (AS, SC), contratto NIH n. 75N9301900065 (DW, AS), U01 AI141995-03 (AS, PB) e U01 CA260541-01 (DW). Questo lavoro è stato inoltre supportato in parte da LJI Institutional Funds, John and Mary Tu Foundation (DS), NIAID under K08 award AI135078 (JMD), UCSD T32s AI007036 e AI007384 Infectious Diseases Division (SIR, SAR) e Bill and Melinda Gates Foundation INV-006133 da Therapeutics Accelerator, Mastercard, Wellcome, contributi filantropici privati ​​(KMH, EOS, SC) e un FastGrant di Emergent Ventures a sostegno della ricerca COVID-19. Questo lavoro è stato parzialmente supportato dal contratto dei centri di eccellenza NIAID per la ricerca e la sorveglianza sull’influenza (CEIRS) HHSN272201400008C (FK, per la generazione di reagenti), il contratto 75N93019C00051 dei Collaborative Influenza Vaccine Innovation Centers (CIVIC), la fondazione JPB (FK, VS), la Fondazione Cohen (VS, FK) e l’Open Philanthropy Project (n. 2020-215611; FK, VS ), nonché da altre donazioni filantropiche. Ringraziamo anche tutti i COVID-19 e i soggetti umani sani che hanno reso possibile questa ricerca attraverso le loro generose donazioni di sangue.Contributi dell’autore: Concettualizzazione, SC, AS e DW; Indagine, JMD, JM, YK, KMH, EDY, CEF, AG, SH e CN; Analisi formale, JMD, JM, YK, KMH, CEF, SH, BP, DW, AS e SC; Reclutamento e campioni di pazienti, SIR, AF, SAR, FK, VS, DMS e DW; Risorse materiali, FK, VS, VR, EOS, DW, AS e SC; Cura dei dati, YK, JMD, JM e SH; Scrittura, YK, JMD, JM, SIR, DW, AS e SC; Supervisione, DW, AS e SC, Project Administration, AF Interessi concorrenti:AS è consulente per Gritstone, Flow Pharma, Merck, Epitogenesis, Gilead e Avalia. SC è un consulente per Avalia. LJI ha richiesto la protezione del brevetto per vari aspetti dell’epitopo delle cellule T e del lavoro di progettazione del vaccino. Il Monte Sinai ha concesso in licenza i test sierologici a entità commerciali e ha presentato domanda di protezione del brevetto per i test sierologici. DS, FA, VS e FK sono elencati come inventori nella domanda di brevetto in attesa (FK, VS) e nei vaccini SARS-CoV-2 basati sul virus della malattia di Newcastle (NDV) che nominano FK come inventore. Tutti gli altri autori dichiarano di non avere conflitti di interesse. Disponibilità di dati e materiali:Tutti i dati sono forniti nei materiali integrativi. I pool di epitopi utilizzati in questo documento saranno messi a disposizione della comunità scientifica su richiesta ed esecuzione di un accordo di trasferimento di materiale. Quest’opera è rilasciata con licenza Creative Commons Attribution 4.0 International (CC BY 4.0), che consente l’uso, la distribuzione e la riproduzione senza restrizioni con qualsiasi mezzo, a condizione che l’opera originale sia adeguatamente citata. Per visualizzare una copia di questa licenza, visitare https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/ . Questa licenza non si applica a figure/foto/opera d’arte o altri contenuti inclusi nell’articolo che sono accreditati a terzi; ottenere l’autorizzazione dal titolare dei diritti prima di utilizzare tale materiale. (Fonte: https://www.science.org/doi/10.1126/science.abf4063). 
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