Gli effetti antitumorali delle cellule CD8 + T possono essere bloccati nel microambiente tumorale, anche attraverso la funzione soppressiva delle cellule T regolatori (T regs ). I sistemi standard in vitro non riescono a ricapitolare le condizioni che le cellule immunitarie sono esposte in vivo. Budhu et al ha utilizzato un sistema tridimensionale del collageno-fibrino per indagare gli effetti delle cellule T CD8 + sulle cellule melanoma coculturate prelevate dai tumori del topo.
L’attività antitumorale delle cellule T CD8 + è stata inibita dalla presenza di T regs derivanti da tumori che dipendevano dal contatto cellulare o dalla prossimità, e che richiedevano la citocina TGF-β sul T regcellulare, determinando l’aumento della espressione della superficie cellulare del recettore del punto di controllo immunitario PD-1 sulle cellule CD8 + T. Un anticorpo bloccante contro TGF-β ha impedito l’immunosoppressione, suggerendo una strategia terapeutica per inibire l’ attività T reg nei tumori.
Le cellule T regolatori (T regs ) sopprimono l’immunità antitumorale, inibendo l’uccisione di cellule tumorali da cellule T CD8 + specifiche antigeniche . Per meglio comprendere i meccanismi coinvolti, abbiamo usato colture tridimensionali collageno-fibrin ex vivo tumori melanoma B16 dissociati. Questo sistema ha riassunto la soppressione in vivo dell’immunità antimelanomica, rendendo le cellule tumorali dissociabili resistenti all’uccisione di cellule T attivate cocculturate attivate, antigene. L’immunosoppressione non è stata osservata quando i tumori sono stati eliminati da T reg– furono coltivati i topi in questo sistema. Gli esperimenti con anticorpi neutralizzanti hanno dimostrato che anche il blocco del fattore di crescita trasformante-β (TGF-β) ha impedito l’immunosoppressione. L’immunosoppressione dipende dal contatto cellulare o dalla vicinanza cellulare perché i fattori solubili delle colture di gel di collagene-fibrina non hanno inibito l’uccisione delle cellule tumorali da parte delle cellule T. Inoltre, la microscopia intravitale a due fotoni ha mostrato che le cellule T effettore Pmel-1 specifiche tumorali hanno interagito fisicamente con T regs resident tumorali nei topi. T regs isolati dai soli tumori B16 erano sufficienti a sopprimere l’uccisione mediata da cellule CD8 + T, che dipendeva da TGF-β legato alla superficie sui T regs . Immunosoppressione di CD8 +Le cellule T correlavano con una diminuzione dell’abbondanza della proteina citilitica granzyme B e un aumento della quantità di superficie cellulare della proteina 1 della morte cellulare programmata dal recettore immunitario (PD-1). Questi risultati suggeriscono che il contatto tra T regs e le cellule T antitumorali nel microambiente tumorale inibisce l’immunitario antimelanomico in un modo TGF-β dipendente e evidenziano potenziali modi per inibire terapeuticamente T regimi intratumorali .
È ben accertato che il sistema immunitario è in grado di riconoscere ed eliminare la crescita tumorale neoplastica; tuttavia, la successiva modifica del tumore da parte del sistema immunitario e altri meccanismi soppressivi permettono ai tumori di sfuggire ad ulteriore distruzione immunitaria ( 1 , 2 ). Oltre a rendere il sistema immunitario ignorante alla loro presenza, i tumori possono in alternativa utilizzare processi più attivi per sopprimere l’immunità antitumorale. Sebbene diversi tipi di cellule inibitoriali [quali le cellule T-cellule regolatrici (T regs ), le cellule soppressori derivanti dal mieloide e le cellule T killer naturali] infiltrano tumori del melanoma B16 durante la loro crescita, è ben accertato che i T regscontribuiscono all’inibizione dell’antita ‘ risposta immunitaria ( 3– 5 ). L’efficacia di molti approcci immunotherapeutici che mirano ai recettori co-inibitori e ai costimolatori delle cellule T è correlata a un equilibrio alterato nel rapporto tra le cellule T effettori a T regs a favore delle cellule effettrici ( 3 , 6 , 7 ). Nonostante l’evidenza che T regs inibisca l’immunitario antimelano, resta la domanda di dove e attraverso quale meccanismo T regs inibiscono la risposta immunitaria antitumorale. T regspuò inibire le risposte T cellule specifiche per antigene tumorali attraverso diversi meccanismi, incluso il rilascio di citochine soppressive [come il fattore di crescita di trasformazione-β (TGF-β), l’interleuchina-10 (IL-10) e IL-35] IL-2, lisi delle cellule efficaci attraverso granzyme e perforina, attenuazione delle cellule che presentano antigene (APCs) attraverso la molecola inibitoria proteina associata alla citotossica T linfocitaria T (CTLA-4), idrolisi dell’adenosina trifosfato extracellulare mediante CD39 e attivazione adenosina monofosfato ciclico (cAMP), repressore iniziale cAMP indottabile e fattore nucleare di cellule T attivate ( 8 ). I meccanismi che T regsl’uso per sopprimere le cellule effettive è dipendente dal contesto e fattori quali il tipo di cellule target, il sito dell’infiammazione e gli stati di attivazione delle cellule e T regs possono influenzare la soppressione. Inoltre, sembra che i regimi di T devono entrare in contatto diretto con le cellule T effettori per sopprimere la segnalazione di T cell receptor (TCR) e che questo stato suppressivo nelle cellule effettivi sia mantenuto anche quando i T regs vengono rimossi dalle colture ( 9 ).
Una domanda fondamentale per quanto riguarda T reg soppressione mediata è se T REGSsopprimere l’innesco di cellule T antigene-specifiche naive, tumorali nel nodo tumore drenaggio linfatico (TDLN) o la fase effettrice delle risposte delle cellule T nel microambiente tumorale. È evidente che le cellule tumorali specifiche dell’antigene tumorale possono essere iniettate in vivo negli organi linfoidi secondari e che queste cellule attivate possono essere trovate all’interno dei tumori. In precedenza abbiamo riportato che le cellule CD8 + T transgeniche TCR specifiche (gp100) -pecifiche (Pmel-1 CD8 + T cellule) sono innescate e attivate in modo efficiente negli animali da tumore B16 ( 10 ). Anche se trasferito in modo omologato Pmel-1 CD8 +Le cellule T dimostrano la capacità citolitica periferica e mostrano intratumor, riconoscimento specifico di antigene degli obiettivi del tumore cognato, non sono in grado di indurre una regressione tumorale ( 10 ). Osservazioni analoghe sono state ottenute da esperimenti con cellule CD8 + T transgeniche OT-1 TCR e tumori B16 che esprimono una forte ovalbumina antigene straniera (B16-OVA), dimostrando che la resistenza degli antigeni non è responsabile del risultato osservato ( 10 ).
Qui descriviamo un esame ex vivo che ricapitola gli effetti soppressivi del microambiente tumorale in vivo. Abbiamo mostrato che T regs da tumori B16 soppresso l’uccisione di cellule tumorali esplosive da cellule CD8 + T antigeniche specifiche in un modo dipendente dal contatto. Le cellule CD8 + T soppresse avevano ridotte quantità di granzyme B e aumentavano le quantità della proteina di morte programmata proteina 1 (PD-1) programmata dalla proteina inibitoria rispetto a quelle delle cellule T CD8 + non sovvenzionate . Inoltre, gli anticorpi neutralizzanti contro TGF-β limitati alla superficie su T regs hanno bloccato la soppressione e hanno ripristinato l’uccisione di cellule tumorali mediate dalle cellule CD8 + T. Questi dati suggeriscono che il targeting T regs (con anticorpi anti-TGF-β o altre immunoterapie) in vivo potrebbe fornire vantaggi terapeutici in un ambiente clinico.
RISULTATI
Le colture tridimensionali di collagene-fibrina Ex vivo mantengono l’immunosoppressione presente nel microambiente tumorale
T reg svolgono un ruolo importante nel sopprimere l’immunità antimelanoma ( 4 , 5 ). Per studiare se T reg in melanomi topo mediare la soppressione delle cellule T citotossiche nel microambiente tumorale, abbiamo utilizzato un ex vivo tridimensionale (3D) di collagene-fibrina gel di co-coltura saggio di uccidere descritto in precedenza ( 11 ). Le colture di gel di collagene-fibrina in combinazione con un test clonogenico per la valutazione di cellule melanoma vivibili possono consentire una misurazione precisa dell’efficienza dell’uccisione di cellule tumorali del melanoma B16 da cellule CD8 + T. Questo saggio di citotossicità imita un ambiente 3D-like. Inoltre, le culture sono stabili per lunghi periodi di tempo, consentendo la valutazione del CD8 +L’assassinio delle cellule T delle cellule melanoma per diversi giorni.
Abbiamo impiantato che le cellule B16-OVA intradermicamente sui fianchi dei topi C56BL / 6 isolano i tumori 10 giorni dopo l’inoculazione. Dopo l’escissione, i tumori sono stati dissociati meccanicamente in sospensioni a cellule singole ( Figura 1A ). Il numero di cellule tumorali vitali e le cellule immunitarie infiltranti sono state valutate con esclusione di tripan blu. Le cellule tumorali B16-OVA dissociate sono state co-embedded con cellule T cellule OT-1 in vitro attivate (TCR transgeniche CD8 + T cellule specifiche per OVA 257-64 ) a un rapporto cellule tumor cellule a cellule T da 50: 1. Ventiquattro, 48 e 72 ore dopo, i gel sono stati sciolti enzimaticamente con collagenasi e tripsina e il numero di residui cellule tumorali vive sono state quantificate placcando le cellule e analizzando la formazione della colonia ( Figura 1A). In questa impostazione, la colonia conta riflette il numero di rimanenti cellule tumorali vitali che resistevano all’uccisione da parte delle cellule T. Le cellule OT-1 uccidono le cellule B16-OVA continuamente ad una velocità esponenziale ( 11 ). Questo può essere rappresentato schematicamente come una linea retta negativa-inclinata su un tracciato semilogico di cellule tumorali vitali ( Figura 1B ). Se c’è meno uccisione (o se l’uccisione è soppressa), il pendio della linea diventa più positivo ( Figura 1C ). Quando non esistono cellule T presente in questi gel, le cellule tumorali continueranno a crescere in modo esponenziale nel tempo, che può essere schematicamente illustrato da una linea retta positiva ( Fig. 1 , B e C). Inoltre, un’equazione precedentemente descritta ( Fig. 1D) viene utilizzato per calcolare l’efficienza di uccisione delle cellule T CD8 + , rappresentata dalla costante di uccisione k in questa equazione.
(Da A a D ) Illustrazione e rappresentazione del modello e della tecnica utilizzata in questo studio. (A) I tumori del melanoma che esprimono gli antigeni T cellule OVA e Pmel-1 (B16-OVA) vengono eliminati dai topi C57BL / 6 10 giorni dopo l’impianto e dissociati in sospensioni a cellule singole. I gel di collagene-fibrina vengono preparati in forme di coltura di tessuti a 48 pozzetti contenenti cellule B16-OVA da colture in vitro o cellule B16-OVA dai tumori dissociati in presenza o in assenza di cellule CD8 + T antigeniche specifiche . I gel vengono lisi quotidianamente con collagenasi e tripsina e il numero di residui vitali B16-OVA viene valutato con un dosaggio clonogenico come descritto in precedenza ( 11). (Da B a D) Illustrazione dell’utilizzo del saggio di assassinio del gel di collagene-fibrina 3D per misurare qualitativamente la soppressione di uccisione di cellule T dal microambiente del tumore con un’ipotetica rappresentazione di diagrammi di semilogio mostrando il numero previsto di cellule B16 vitali recuperate da collagene-fibrina gel in cui è avvenuta l’uccisione mediata da cellule T (B) o l’immunosoppressione dell’uccisione (C). (D) Equazione che modella l’uccisione delle cellule tumorali mediate dalle cellule T in gel collagene-fibrin per calcolare l’efficienza di uccisione, k , come descritto in precedenza ( 11 ).
Utilizzando questo approccio, abbiamo prima stabilito se le colture di gel collagene ex vivo potrebbero ricapitolare l’immunosoppressione che si verifica nei tumori B16 in vivo. In effettore vitro attivato OT-1 CD8 + cellule T (5 x 10 5 cellule vitali per gel) sono stati messi in coltura in gel di collagene-fibrina sia con cellule B16-OVA tessuto-coltura (1 × 10 4 cellule vitali per gel) o singola Sospensioni di cellule di tumori B16-OVA dissociati (1 x 10 4 cellule tumorali vitali per gel). Si noti che i tumori B16 dissociati generalmente contenevano circa tre volte più vivibili (trypan blu-negativi) che infiltrarono le cellule immunitarie di cellule tumorali vitali ( Fig. 2A ), simili a quanto precedentemente riportato ( 10). Queste colture sono state incubate per 24 e 48 ore, dopo di che il numero di residui cellulari vitali del melanoma è stato determinato utilizzando un dosaggio clonogenico. Coerentemente con un precedente rapporto ( 11 ), le cellule B16 coltivate in tessuto sono state uccise continuamente nel tempo quando sono state coltivate con cellule OT-1 ( Fig. 2B , a sinistra). Le cellule OT-1 hanno ucciso le cellule tumorali B16-OVA dissociate e le cellule B16-OVA coltivate in modo equivalente entro le prime 24 ore nei gel di collagene-fibrina; tuttavia, dopo 24 ore, l’uccisione delle cellule tumorali dissociate è stata notevolmente ridotta. Le cellule tumorali B16-OVA dissociate hanno cominciato a crescere nei geli ad un tasso simile a quello delle cellule tumorali da sole ( Fig. 2B, in mezzo). Questa soppressione degli uccisioni di cellule ha determinato una diminuzione del 34% della percentuale di cellule tumorali B16-OVA dissociate uccise rispetto alle cellule B16-OVA colte al punto temporale di 48 ore ( Fig. 2C ), con una riduzione di otto volte l’efficienza di uccisione delle cellule T CD8 + misurate dalla costante di velocità di uccisione k ( Fig. 2D ). Risultati simili sono stati ottenuti da esperimenti con cellule CD8 + T da un topo transgenico TCR che riconosce l’antigene melanoma gp100 (cellule Pmel-1 CD8 + T), che hanno dimostrato che i tassi di uccisione e la soppressione dell’uccisione non dipendevano dalla forza antigene ( Fig. 2E ).
(Da A a E ) I tumori B16-OVA sono stati eccitati e digeriti con collagenasi e poi disaggregati meccanicamente in sospensioni a cellule singole. I tumori dissociati sono stati co-incorporati in gel collagene-fibrin con cellule OT-1 in vitro attivate con un rapporto 50: 1 effettivo / obiettivo (E: T). (A) Sono stati determinati il numero di cellule tumorali vitali e infiltrati di cellule immunitarie isolate da tumori dissocati di 10 giorni B16-OVA. I dati sono mezzi ± SEM di otto esperimenti. (B) Sono stati misurati i numeri di cellule di melanoma vivibili recuperate dai gel ai tempi indicati. I dati sono mezzi ± SEM di tre esperimenti indipendenti eseguiti in duplicato. (C) Le percentuali delle cellule B16 uccise sono state determinate. I dati sono mezzi ± SEM di otto esperimenti eseguiti in (A). (D) Valore calcolato di k± SEM dagli esperimenti eseguiti in (A) utilizzando l’equazione b t = b 0 e -pt + gt , come descritto nei Materiali e nei Metodi. (E) Le percentuali delle cellule tumorali B16 uccise sono state determinate. I dati sono mezzi ± SEM a 24 ore utilizzando numeri equivalenti (5 × 10 5 cellule per gel) di cellule OT-1 o Pmel CD8 + T in collagene- fibrinococulture di cellule B16-OVA. * P ≤ 0,05, ** P ≤ 0,01 e *** P ≤ 0,005. ns, non significativo.
Poiché i tumori dissociati contengono non solo le cellule tumorali, ma anche i linfociti infiltranti ei componenti stromali, questi risultati hanno suggerito che le cellule presenti nei tumori dissociati e in tutti i fattori che hanno prodotto hanno soppresso l’attività citolitica delle cellule T CD8 + . Inoltre, abbiamo riscontrato che la manutenzione dell’ambiente soppressivo era dipendente dalla presenza del collagene e della fibrina, poiché le colture 2D degli stessi dissociati tumori B16-OVA non riuscivano a ricapitolare la soppressione osservata nei gel ( Fig. 2B , a destra). In queste colture 2D, le cellule tumorali B16-OVA dissociate sono state uccise in modo più efficiente di quelle delle cellule B16-OVA coltivate al tessuto ( Fig. 2, C e D). Questi dati suggeriscono che la matrice extracellulare 3D che circonda i tumori svolge un ruolo importante nel sostenere il microambiente tumorale immunosoppressivo.
L’esaurimento in vivo di T regs nei topi Foxp3-DTR determina la perdita di immunosoppressione ex vivo
Dopo aver stabilito che i geni del collageno-fibrina 3D ricapitolavano il tipo di immunosoppressione osservato nei tumori in vivo, abbiamo esaminato se i T regs erano responsabili della soppressione delle cellule T CD8 + nel microambiente tumorale. Abbiamo impiantato i topi Foxp3-DTR [topi transgenici con espressione del recettore del tossina della difterite (DT) guidati dal promotore Foxp3 ] ( 4 ) con tumori B16-OVA per ridurre T regs prima dell’escissione tumorale. Una singola dose (45 ng) di DT è stata iniettata 9 giorni dopo l’impianto del tumore ei tumori sono stati eliminati dopo due giorni. Questo programma di trattamento è stato ottimizzato per ridurre il numero massimo di T regs(range, 60-85%) nei topi Foxp3-DTR senza avere un effetto statisticamente significativo su altre popolazioni di cellule immunitarie all’interno del tumore (fig. S1) ( 4 ). Il trattamento con DT ha abolito completamente la soppressione osservata rispetto ai tumori di controllo eccedenti da topi di tipo selvatico (WT) o dai topi Foxp3-DTR ( Fig. 3A ). La quantità di uccisione osservata era paragonabile a quella delle colture B16 coltivate, anche se i regimi di T non erano completamente esauriti dai tumori con questo regime di trattamento ( Fig. 3 , A e B). Inoltre, il calcolo della costante di uccisione k e la percentuale di cellule B16 uccise hanno mostrato che l’efficienza di uccisione delle cellule OT-1 nel T reg– tumori interrotti erano simili a quelli delle colture B16 coltivate in cui non esistevano cellule soppressive ( Fig. 3 , C e D).
(Da A a D ) i topi Foxp3-DTR sono stati trattati con DT per ridurre i livelli di T 2 giorni prima dell’esecuzione dell’escissione del tumore, come descritto nei Materiali e nei Metodi. I tumori dissociati sono stati co-embedded in gel collagene-fibrin con cellule OT-1 in vitro attivate ad un rapporto 50: 1 effector-to-target. (A) Al tempo indicato, i gel sono stati disciolti e il numero delle restanti cellule B16 è stato misurato utilizzando un dosaggio clonogenico. I dati sono mezzi del numero di cellule B16 vitali ± SEM da tre esperimenti eseguiti in duplicato. (B) Parti rappresentative (contenute su cellule immunitarie CD45 + ) di CD4 + Foxp3 + T regsnei tumori B16-OVA con o senza trattamento DT. (C) Le percentuali delle cellule B16 uccise nelle condizioni indicate sono state determinate. I dati sono mezzi ± SEM da tre esperimenti eseguiti in duplicato come descritto in (A). (D) Valori medi di k ± SEM dagli esperimenti eseguiti in (A). * P ≤ 0,05 e ** P ≤ 0,01.
T regs rappresentano una piccola parte delle cellule totali all’interno del microambiente del tumore, ma è possibile che l’induzione dell’apoptosi da solo attraverso l’impegno DTR possa alterare il microambiente del tumore, rendendo il tumore suscettibile di uccidere nei gel di collagene-fibrina. Per escludere questa possibilità, abbiamo eseguito un esperimento di controllo in cui abbiamo esaurito un sottogruppo di cellule mieloidi (che rappresentano una parte più grande dello stroma tumorale rispetto a quelle di T regs ) utilizzando topi CCR2-DTR ( 12 ). CCR2 si esprime principalmente sulla popolazione mieloide monocitica CD11b + all’interno dei tumori ed è stato precedentemente dimostrato che l’esaurimento delle cellule CCR2 + con DT nel modello melanoma B16 non influenza la crescita tumorale in vivo ( 12). In linea con i dati precedenti, abbiamo riscontrato che i tumori esauriti con CCR2 sono rimasti soppressivi nei geni collagene-fibrin ex vivo (fig. S2).
Sebbene il trattamento DT dei topi Foxp3-DTR abbassasse 60-85% dei T regs nei tumori in vivo, l’esame dei T regs rimasti in gel collagene-fibrin ha mostrato che la percentuale di T regscontinuava a diminuire nel tempo. Ciò suggerisce che il trattamento in vivo con DT continuasse a modulare la capacità dei restanti T regs di sopprimere l’uccisione. Abbiamo scoperto che semplicemente ridurre il numero di T regs ex vivo con altri mezzi era insufficiente a ridurre la soppressione. Abbiamo usato perline magnetiche anti-CD25 per ridurre le regioni di T dalle sospensioni delle cellule tumorali ex vivo. Questo metodo ha ridotto il numero di regole Tdal 50 al 60% nei tumori dissociati; tuttavia, non era sufficiente ripristinare l’uccisione di cellule tumorali dalle cellule CD8 + T (fig. S3A). Osservazioni simili sono state effettuate usando l’anticorpo anti-CD25-depletante (PC61) in vivo in un modello tumorale B16-OVA in cui è stata raggiunta una riduzione del 40-50% di T regimi intratumorali e non è stata osservata alcuna regressione tumorale ( 5 ). Inoltre, l’aggiunta di T regspurificato con branelli magnetici anti-CD25 alle colture di gel di collagene-fibrin non ha soppresso l’uccisione mediata da cellule OT-1 di cellule B16-OVA coltivate (fig. S3B). Ulteriore supporto a questa constatazione proviene da uno studio che ha mostrato che il trattamento con un recettore del fattore di necrosi tumorale indotta da glucocorticoidi (TNFR) proteina -related (GITR) anticorpo agonista (DTA-1), in grado sia di esaurire T intratumorale REGS e indurre lineage instabilità nei restanti T regs tali che non sono più suppressivi, ha ripristinato l’assassinio ex vivo di tumori B16 similmente al trattamento DT in topi Foxp3-DTR ( 13 ). Ciò suggerisce che anche se T regimi intratumorali sono responsabili della soppressione del CD8 + L’assassinio di cellule-mediato T osservato nei nostri studi, deve essere abbassato abbastanza o reso non-suppressivo.
Il blocco di TGF-β inverte l’immunosoppressione ex vivo per il microambiente tumorale
T REGS possono sopprimere le risposte immunitarie attraverso la secrezione di fattori solubili, come IL-10, TGF-β, e IL-35, o attraverso il contatto cellula-cellula e, eventualmente, uccisione diretta delle cellule bersaglio ( 14 – 16 ). L’intervento in questi percorsi soppressivi per la disfunzione genetica dei recettori o per gli anticorpi neutralizzanti ritarda la crescita del tumore del melanoma, ma il loro contributo al microambiente tumorale non è stato delineato ( 17 ). Utilizzando anticorpi bloccanti nelle colture di gel di collagene-fibrina, abbiamo chiesto se uno di questi fattori contribuito al T reg– soppressione mediata osservata nel microambiente tumorale. L’aggiunta di anticorpi bloccanti contro il recettore IL-10 (IL-10R) e IL-35 non ha avuto alcun effetto sulla soppressione osservata nei tumori B16 dissociati nelle colture di collagene-fibrina ( Fig. 4 , A e B). Tuttavia, bloccando TGF-β invertito soppressione e ripristinato OT-1 efficienza uccidere cellule ad una velocità simile a quella osservata con cellule in coltura B16-OVA e T reg -depleted tumori ( Figg. 3 , C e D, e 4 , A e B ). Il blocco di TGF-β non ha avuto alcun effetto sulla crescita delle cellule B16-OVA dissociate in assenza di cellule T di OT-1 né ha influenzato la crescita o l’uccisione delle cellule B16 colture in gel di collagene-fibrina ( Figura 4C ). T reg– la soppressione mediata non sembra essere dipendente dal coinvolgimento TCR da T regs nelle culture perché il blocco del complesso di istocompatibilità maggiore (MHC) II non ha ripristinato l’uccisione del tumore ( Fig. 4 , A e B).
(Da A a C ) I tumori B16-OVA sono stati esclusi e dissociati come descritto in Fig. 2 . I tumori dissociati sono stati co-incorporati in gel collagene-fibrin con cellule OT-1 in vitro attivate con un rapporto effettivo / obiettivo di 50: 1 in presenza o in assenza di anticorpi bloccanti (Ab) contro TGF-β, IL- 10R, MHC II o IL-35 (tutti a 10 μg / ml). (A) Sono state determinate le percentuali delle cellule B16 uccise a 48 ore. I dati sono mezzi ± SEM di tre esperimenti eseguiti in duplicato. (B) Sono stati determinati i valori medi di k ± SEM dagli esperimenti eseguiti in (A). (C) Sono stati determinati i numeri medi di B16 clonogenici rimasti ai tempi indicati. I dati sono mezzi ± SEM di tre esperimenti eseguiti in duplicato. *** P ≤ 0,005.
T regs interagisce con cellule tumorali specifiche tumorali Pmel-1 all’interno di tumori B16
Considerando che l’esaurimento dei T regs altera la crescita tumorale del melanoma in vivo e elimina la soppressione dell’assassinazione mediata da cellule CD8 + T ex vivo, sembra logico che le regioni di T siano la causa principale dell’immunosoppressione intratumorale ( 4 , 5 , 10 ). È stato dimostrato in precedenza che l’infiltrazione di cellule CD8 + T all’interno del microambiente tumorale coincide con un reclutamento arricchito di T regs rispetto alla periferia ( 10 ). Anche se T regse le cellule T effettivo colocalizzano nelle stesse regioni dei tumori B16, poco si sa sulle interazioni che si verificano tra queste due popolazioni. Poiché T regs controlla le risposte immunitarie in modo dipendente dal contatto ( 18 , 19 ), abbiamo esaminato se si sono verificate interazioni tra cellule T CD8 + T e T regs tumorali nei tumori B16. Attraverso un modello di imaging intravitale del melanoma B16, i topi transgenici fucinati a fusione fucile Fox-green-green (GFP) furono impiantati con cellule melanoma B16 espresse con fluorescenza di colore giallo (YFP-B16) ( 10 , 20 ). Tre giorni dopo l’impianto del tumore, Pmel-1 CD8 esprimente proteina fluiva del ciano+ Le cellule T (CFP-Pmel) sono state trasferite in modo omogeneo nei topi tumorali Foxp3-GFP. I tumori sono stati poi fotografati a partire da 7 giorni dopo il trasferimento adottivo delle cellule CFP-Pmel (giorno 10 della crescita tumorale) come descritto in precedenza ( 10 ). Questa procedura ha permesso la visualizzazione delle interazioni tra le cellule T CFP-Pmel e Foxp3-GFP T regs nel contesto del tumore YFP-B16. Le cellule T di CFP-Pmel sono state trovate in regioni altamente infiltrate da T regs ( Fig. 5A e film S1). A seguito di un esame approfondito, era evidente che molte cellule T di CFP-Pmel erano in stretto contatto con, o venivano a contatto con, Foxp3-GFP T regs durante i periodi di imaging ( Figura 5A , inset e film S2).
( A e B ) le cellule tumorali YFP-B16 sono state sospese in Matrigel e inoculate sottocutanea in topi Foxp3-GFP. Tre giorni più tardi, 3 × 10 5 naive CFP-Pmel CD8 + T cellule sono state trasferite mediante iniezione della coda della coda. I topi sono stati quindi fotografati come descritto nei Materiali e nei Metodi. I maghi del tempo sono stati analizzati per le interazioni delle cellule T CD8 +CFP-Pmel T (cyan) con T regs (rosso) come descritto in Materiali e Metodi. (A) In alto: frame rappresentativi da una singola regione di un’immagine a sei tempi di time-lapse. In basso: Immagini ingrandite dalla regione circondata dalla casella gialla. Foxp3-GFP T regssono raffigurati in rosso, le cellule CFP-Pmel sono rappresentate in ciano e le cellule tumorali YFP-B16-OVA sono rappresentate in verde. I telai vengono separati in tempo da 6 min 12 s. (B) I punti sulle trame rappresentano le singole cellule segnate per la prossimità (entro 10 μm) o il contatto con un regolo T durante l’imaging (vedere Materiali e metodi). In alto: i dati sono mezzi ± SEM dell’intera popolazione di cellule. Peggiori: I dati sono medie ± SEM di solo le cellule che avevano interazioni con T reg . Tutte le celle tracciate per più di cinque punti di tempo da quattro topi sono rappresentati.
Per quantificare la durata di queste interazioni, abbiamo generato un punteggio ponderato sia per il contatto che per la prossimità in ciascun punto temporale per ciascuna cellula T Pmel-1 tracciata per almeno 10 punti temporali (vedere Materiali e metodi). Più del 40% delle cellule T visualizzate Pmel-1 hanno dimostrato la prossimità (entro 10 μm) o il contatto con T regs . Come popolazione totale, le cellule Pmel-1 T hanno trascorso il 10% del loro tempo a contatto e il 25% del loro tempo entro 10 μm di T regs all’interno dei tumori YFP-B16 ( Figura 5B ). Su, cellule medi PMEL-1 T che avevano almeno un’interazione con un T reg stati trovati in contatto o in prossimità di t REGS25 e il 68% del tempo, rispettivamente. Tuttavia, non abbiamo osservato differenze sostanziali tra i punteggi di interazione e la mobilità di Pmel-1 all’interno del microambiente del tumore, simile a quanto riportato in precedenza nei linfonodi (LNs) (fig. S4A) ( 18 ). C’è stato un piccolo ma statisticamente significativo aumento ( P <0,005) nell’area di movimento nelle cellule T che hanno interagito con T regs rispetto a quelli che non hanno (fig. S4B). Sebbene i T regs siano supposti per sopprimere la funzione di effetto T cellule all’interno del microambiente del tumore, sembra che non lo hanno fatto diminuendo la motilità delle cellule effettivo.
T regs sopprimono la funzione CD8 + T effector della cella attraverso il TGF-β legato alla superficie
Dato l’osservazione che T regs erano proximali e interagito con le cellule CD8 + T all’interno del microambiente del tumore in vivo ( Figura 5 ), abbiamo valutato quanto siano importanti queste interazioni per la capacità dei T regs di sopprimere l’uccisione delle cellule tumorali. Poiché entrambi i meccanismi a contatto e solubili sono stati descritti per TGF-β-mediata soppressione da T regs ( 14 , 21 ), abbiamo studiato se la soppressione nei tumori dissociati potrebbe essere trasferita da un tumore non trattato a T reg tumori ( 19 , 22 ). Gel di collagene-fibrin contenenti sospensioni singole da T regi tumori interrotti e le cellule OT-1 sono state collocate nel vano superiore di inserti di coltura a cellule a 24 pozzetti e gel di collagene-fibrin contenenti tumori non trattati sono stati aggiunti al fondo delle piastre a 24 pozzetti (fig. S5A). Se i fattori solubili secchi dalle cellule tumorali o dai loro infiltrati erano responsabili della soppressione, ci aspetteremmo di osservare l’inibizione dell’uccisione dopo 24 ore. L’esame delle cellule tumorali vitali rimaste negli inserti dopo 24-48 ore di coltura ha mostrato che le cellule OT-1 continuavano ad uccidere le cellule tumorali, suggerendo che la soppressione non era trasferibile (fig. S5, B e C). Questi dati suggeriscono che T regs o inibisce CD8 +La citotossicità delle cellule T mediante TGF-β legato alla superficie o produrre TGF-β solubile che può esercitare solo il suo effetto nella stretta vicinanza osservata all’interno del microambiente tumorale. In accordo con l’ipotesi precedente, abbiamo riscontrato che l’abbondanza di TGF-β sulla superficie degli intratumori T regs era maggiore di quella sulle cellule efficaci CD4 + o CD8 + T cellule ( Fig. 6A ). Per conciliare completamente il meccanismo con cui T regs ha modulato la funzione T cellula citolitica e confermare che i T regs da soli erano sufficienti per la soppressione osservata, abbiamo ordinato T regs da Fascismo attivato fluorescenza-attivazione (FACS) da tumori non trattati e li ha aggiunti a T regtumori interrotti o alle cellule B16-OVA coltivate. Inoltre, per determinare se TGF-β legato al solubile o alla membrana era responsabile della soppressione, abbiamo pretreinato una parte di questi regimi T con anticorpi bloccanti contro TGF-β legato alla superficie. Aggiunta 20.000 T filtrate REGS (corrispondenti ad un 1:25 T reg rapporto cellulare -per-effector) per colture in gel di collagene-fibrina parzialmente ripristinato la soppressione in T reg -depleted tumori ( Fig. 6B ). Questo è stato associato ad un aumento di circa due o tre volte nel numero di cellule tumorali vitali che sono rimaste nei gel dopo 72 ore e una diminuzione del 40-50% del tasso di uccisione ( Tabella 1 ). Anche se questi dati suggeriscono che T regssono la causa principale dell’inibizione immunitaria nel microambiente del melanoma, non escludono la possibilità che T regs cooperino con altre cellule del tumore per sopprimere la citotossicità cellulare CD8 + . Tuttavia, l’aggiunta di T regsalle colture B16-OVA in gel collagene-fibrin era sufficiente a sopprimere parzialmente l’uccisione da parte delle cellule OT-1 in una misura che era all’interno della gamma osservata in tumori non trattati ( Fig. 6C ).
( A ) I tumori B16-OVA da topi non trattati sono stati tagliati e dissociati come descritto nei Materiali e nei Metodi. Sinistra: L’espressione della superficie cellulare di TGF-β sugli effetti CD4 + , sulle cellule CD8 + T e su CD4 + Foxp3 +(GFP + ) T regs è stata valutata mediante citometria a flusso. Sono mostrati gli istogrammi rappresentativi per il controllo isotipo e l’anticorpo anti-TGF-β. A destra: i dati rappresentano l’intensità media di fluorescenza (MFI) ± SEM per TGF-β rispetto a quella o un anticorpo di controllo isotipo per quattro topi per gruppo. T eff , cellula T effettore. ( B e C ) GFP + T regsda tumori nei topi Foxp3-GFP sono stati ordinati da FACS da tumori non trattati e preincubati con anticorpi bloccanti contro TGF-β. T reg (2 × 10 4 cellule) sono stati poi co-integrati con dissociato T reg -depleted B16-OVA tumori (B) o cellule B16-OVA in coltura (C). Al tempo indicato, i gel sono stati disciolti e il numero delle restanti cellule B16 è stato misurato utilizzando un dosaggio clonogenico. I dati sono mezzi ± SEM del numero di cellule B16 provenienti da tre esperimenti eseguiti in duplicato. ( D ) OT-1 CD8 +Le cellule T sono state recuperate da gel collagene-fibrin a 48 ore dopo la coltura nelle condizioni indicate e sono state analizzate mediante citometria a flusso per determinare le relative abbondanze di granzyme B (sinistra) e PD-1 (destra). I dati sono i mezzi ± SEM delle IFM provenienti da analisi triplicate. * P ≤ 0,05 e ** P ≤ 0,01.
Il valore di k (min) per ogni condizione è stato calcolato dall’equazione b t = b 0 e – kpt + gt ei valori ottenuti in Fig. 6B . I decrementi percentuali rispetto al T reg tumori -depleted ad ogni tempo sono riportati tra parentesi.
Anche se abbiamo scoperto che TGF-β è stata espressa sulla superficie dei T regs , ma non le cellule T effettive, esistono altre cellule immunitarie (incluse le cellule mieloide) nel microambiente e nella periferia del tumore che sono in grado di produrre TGF-β e α V integrin (CD51), che si ritiene coinvolto nell’attivazione di TGF-β (fig. S6). Pertanto, l’origine di TGF-β e la sua attivazione possono essere dovuti a più tipi di cellule in vivo e è possibile che le cellule che producano TGF-β siano diverse da quelle che lo attivano. In uno studio precedente, le integrin di α v β 8 su T regs sono state dimostrate coinvolte nel rilascio di TGF-β attivo da complessi predominanti (GARP) di ripetizioni TGF-β-glicoproteina latente sulla superficie di Tregs ( 23 ), suggerendo che questo potrebbe essere un meccanismo chiave da cui sopprimono. Abbiamo scoperto che il pretrattamento di T smistate REGS con anticorpi anti-TGF-beta per bloccare TGF-β solo sulla superficie di T reg , prima della loro aggiunta a colture di gel di collagene-fibrina contenenti o T reg -depleted tumori o cellule B16-OVA coltivate , abolendo la loro capacità di sopprimere ( Fig. 6 , C e D). In entrambi i casi, l’efficienza uccisione di cellule T OT-1 è rimasto simile a quello delle cellule OT-1 T nel T reg -depleted controllo ( Tabelle 1 e 2 ). Insieme, questi dati suggeriscono che TGF-β limitato a superficie su T regs è responsabile di sopprimere l’uccisione mediata dalle cellule OT-1 di tumori B16-OVA nei gel di collagene-fibrina.
Il valore di k (min) per ogni condizione è stato calcolato dall’equazione b t = b 0 e – kpt + gt ei valori ottenuti in Fig. 6C . Le variazioni percentuali rispetto alle soluzioni B16-OVA in ciascun punto temporale sono elencate tra parentesi.
Gli effetti soppressivi dei T regs sono riflessi non solo dall’aumento del numero di cellule tumorali vitali rimaste nei geni del collageno-fibrino dopo 72 ore, ma anche in cambiamenti qualitativi fenotipici osservati nelle cellule T cellule OT-1 CD8 + . OT-1 cellule recuperate dal gel di T reg -depleted o tumori anti-TGF-p-trattati erano aumentati quantità di citolitica effettore molecola granzima B e diminuita superficie espressione cellulare del marcatore T esaurimento delle cellule e del recettore punto di controllo immunitario PD-1 rispetto alle cellule T di OT-1 da tumori di controllo ( Fig. 6D ). Quando T regs sono stati aggiunti indietro, le cellule T di OT-1 mostravano diminuite quantità di granzyme B, mentre la loro espressione superficiale di PD-1 rimase invariata (Fig. 6D ). Abbiamo trovato un cambiamento simile ma sottile nelle abbondanze di PD-1 e granzyme B nelle cellule CD8 + T infiltranti tumorali endogene nel microambiente tumorale dopo l’esaurimento di T regs in vivo con DT (fig. S7).
DISCUSSIONE
Qui abbiamo mostrato che colture di gel di collagene-fibrina recapitolavano le condizioni soppressive del microambiente del tumore in vivo. Le sospensioni a cellule singole di tumori B16 erano resistenti all’uccisione di cellule OT-1 CD8 + T quando erano incorporate in gel collagene-fibrinio 3D, ma non quando le cellule venivano coculturate in una piastra di coltura tissutale 2D. Questa soppressione è dovuta a una diminuzione dell’efficienza di uccisione delle cellule T di OT-1, misurata dalla costante di uccisione k , nonché uno stato funzionalmente esaurito delle cellule T di OT-1, come dimostrato dalla diminuzione della quantità di granzyme intracellulare B e aumentata abbondanza di superficie cellulare di PD-1. Depressione in vivo di T regsnei topi Foxp3-DTR ha invertito la soppressione e ripristinato l’uccisione mediata dalle cellule OT-1 delle cellule tumorali B16. Abbiamo risolto T reg da topi Foxp3-GFP e ha dimostrato che il readdition di T reg di T reg -depleted tumori ha provocato la soppressione di aver ucciso da CD8 + cellule T. Inoltre, l’aggiunta di un anticorpo bloccante a tutte le tre isoforme di TGF-β (clone 1D11) ha ripristinato l’ uccisione delle cellule tumorali B16 mediate dalle cellule CD8 + T. Microscopia intravitale mostrato che adoptively trasferito, CD8 antigene-specifiche + cellule T preso contatto diretto con T reg in B16 tumori in vivo, suggerendo che T reg soppressione mediata di CD8 +La funzione T cellula è dipendente da contatto o da prossimità. Corrispondentemente, bloccando TGF-β solo sulla superficie di T smistate REGS era sufficiente per invertire il loro effetto soppressivo quando sono stati aggiunti a T reg tumori -depleted e cellule B16 coltivate. Questo risultato suggerisce che il TGF-β limitato a superficie su T regs è responsabile del loro effetto soppressivo. Insieme, questi risultati suggeriscono che T regssopprimono l’uccisione di cellule CD8 + T nel microambiente del tumore in un modo di contatto e TGF-β.
Non abbiamo osservato la soppressione di uccisione mediata da cellule CD8 + T di tumori dissociati nei saggi eseguiti in piastre 2D a 24 pozzetti ( Fig. 2 ). Questa scoperta suggerisce che la presenza di collagene e di fibrina è stato necessario conferire T reg soppressione mediata di CD8 + T uccisione delle cellule dei tumori dissociate. Inoltre evidenzia l’importanza delle proteine della matrice extracellulare nel sostenere il microambiente tumorale. Anche se il collagene è la proteina più matura extracellulare presente nella maggior parte dei tessuti, la fibrina è una proteina della matrice patologica. I depositi di fibrina sono stati descritti in diversi tipi di tumore, inclusi i melanomi B16 ( 24 , 25)). Ciò è presumibilmente dovuto alle navi perdute trovate nei tumori che consentono ai componenti del sangue di entrare nel letto del tumore. È probabile che i componenti della matrice extracellulare dei collageni-fibrin gel forniscono crescita o segnali beneficiali (ad esempio mediante il legame con le integrine della superficie cellulare) a T regs e ad altre cellule immunitarie che contribuiscono a mantenere le loro funzioni efficaci.
Ci sono stati diversi rapporti che suggeriscono che T regs non sopprimono direttamente la funzione T cellula efficace nel microambiente del tumore in vivo, ma agiscono in modo agevole attraverso le celle accessorie come le APC ( 8 , 18 , 26 ). Nelle colture di collagene-fibrin gel dei tumori B16 dissociati, vi sono altre cellule immunitarie presenti oltre ai T regs . Pertanto, è possibile che altre cellule del sistema immunitario aiutino T nella loro soppressione. Tuttavia, in un sistema di collagene-fibrina purificato contenente T solo FACS-filtrate REGS e cellule di melanoma B16 coltivate, abbiamo scoperto che T regs soppressi uccidere da OT-1 T cellule ( Fig. 6C); tuttavia, questo effetto soppressivo non era così sostanziale come quello osservato nei tumori B16 dissociati ( Fig. 2B ). Ciò suggerisce che solo T regs sono sufficienti per conferire la soppressione; tuttavia, non esclude la possibilità che T regs agisca in concerto con altre cellule immunitarie, ad esempio APC, per fornire la soppressione delle risposte antitumorali in vivo.
TGF-β è stato ampiamente dimostrato di svolgere un ruolo fondamentale nella tolleranza immunitaria. Abbiamo scoperto che il bloccaggio di TGF-β con un anticorpo monoclonale era sufficiente per invertire la soppressione osservata nelle colture di collagene-fibrina ( Figura 4 ). L’anticorpo bloccante utilizzato, il clone 1D11, blocca tutti e tre le isoforme TGF-β (TGF-β1, TGF-β2 e TGF-β3). Non sappiamo quale isoforma sia responsabile dell’immunosoppressione, ma TGF-β1 è la isoforma predominante trovata nel sistema immunitario ed è stata implicata nell’immunità antitumorale ( 23 , 27 , 28 ). Anche se la maggior parte degli studi si è concentrata sulle forme secrete di TGF-β, molti studi hanno dimostrato un ruolo per TGF-β limitato in superficie su T regs nel sopprimere le risposte immunitarie (19 , 22 ). In accordo con questi studi, abbiamo mostrato che il blocco di TGF-β a superficie limitato specificamente su Tregs ha invertito la capacità di soppressione di questi T regs ( Fig. 6 , B e C). Non è ancora chiaro se il TGF-β collegato a superficie agisce direttamente sui T regs per mantenere la loro attività soppressiva o suppongadirettamente le celluleCD8 + T in modo dipendente dal contatto.
La sintesi, la secrezione e l’elaborazione di TGF-β sono un processo complesso e multistep. Molti tipi di cellule hanno la capacità di produrre e secernere la forma inattiva di TGF-β, che viene poi trattata attraverso diversi meccanismi che coinvolgono proteine di matrice extracellulare, integrine e proteasi ( 29 ). Di conseguenza, è stato suggerito che le funzioni soppressive di TGF-β siano mediate modulando l’estensione dell’attivazione di TGF-β piuttosto che della sua produzione ( 29 ). Nei nostri esperimenti abbiamo scoperto che molte cellule del microambiente del tumore avevano la capacità di produrre TGF-β (fig. S6); tuttavia, non è chiaro quale cellula (s) nel tumore sia la principale fonte del TGF-β. In precedenza è stato riferito che TGF-β derivato da T cellule efficace, ma non T regTGF-β, è responsabile della soppressione dell’immunità antitumorale ( 27 ). Proponiamo che, indipendentemente dalla sorgente di TGF-β, i T regs sono coinvolti nella trasformazione e nell’attivazione di TGF-β e che ciò avviene attraverso le interazioni tra integrine e GARP sulla superficie di T regs ( 23 ).
Sono stati studiati diversi studi clinici sugli effetti del blocco del TGF-β e delle sue vie di segnalazione nei pazienti affetti da tumore ( 30 ). I nostri dati suggeriscono che il targeting T regs in vivo potrebbe fornire benefici clinici. Un approccio attraente a questo è l’utilizzo di immunoterapie che esauriscono specificamente i T regs dal microambiente tumorale senza influenzare sistematicamente i T regs ( 3 , 6 , 31 ). Abbiamo dimostrato in precedenza che il targeting della molecola costitolatoria delle cellule T GITR con l’anticorpo monoclonale DTA-1 deprezza selettivamente T regs dal microambiente tumorale senza influenzare i regimi T periferici ( 3, 13 ). Questa terapia funziona parzialmente impoverendo i regimi di T attraverso processi mediati da Fc ( 32 ). Inoltre, abbiamo dimostrato che DTA-1 altera la stabilità lignaggio dei rimanenti T intratumorale REGS e induce un fenotipo di cellule T effettrici infiammatorie ( 13 ). Negli esperimenti con coculture di collagene-fibrin gel di tumori dissociati, abbiamo riscontrato che il trattamento con DTA-1 era sufficiente a invertire la soppressione dell’uccisione mediata da cellule CD8 + T, in modo simile a depleting T regs dai tumori ( 13 ). Oltre al targeting T regs , l’immunoterapia GITR migliora il CD8 +Funzione di effetto T cell. Così, questa terapia elimina la soppressione nel microambiente tumorale, contemporaneamente rafforzando la funzione T cell effector. Attualmente, sono stati valutati diversi anticorpi monoclonali contro GITR nelle sperimentazioni cliniche di fase 1 per il melanoma e altre malattie maligne. In aggiunta agli anticorpi contro GITR, altri immunoterapie, come gli anticorpi contro CTLA-4 e OX40 [noto anche come necrosi tumorale fattore recettore membro superfamiglia 4 (TNFRS4) e CD134] ( 6 , 7 , 33 , 34 ), riducono T REGSe rafforzare la funzione T cellula efficace da solo o in combinazione con altre terapie, rendendo questo tipo di terapia un approccio attraente al trattamento dei tumori. Insieme, i nostri risultati evidenziano il potenziale clinico di targeting T regs e TGF-β per ripristinare la funzione T cellula efficace all’interno del microambiente tumorale.
MATERIALI E METODI
Topi
Gli esperimenti del mouse sono stati eseguiti in conformità alle linee guida istituzionali in base a un protocollo approvato dal Comitato per la cura e l’uso degli animali istituzionali del Centro di Cancer Memorial di Sloan Kettering (MSKCC). Tutti i topi sono stati mantenuti in una struttura priva di agenti patogeni secondo le linee guida del National Institutes of Health Animal Care. I topi C57BL / 6J (femmine, da 6 a 10 settimane) e topi transgenici OT-1 TCR ( 35) sono stati acquistati da The Jackson Laboratory. I topi transgenici Pmel-1 TCR ( 36 ) sono stati ottenuti da N. Restifo (National Institutes of Health). I topi di Foxp3-GFP sono stati un dono di A. Rudensky (MSKCC). I topi Foxp3-DTR (Foxp3-GDL) erano un dono di G. Hämmerling [Deutsches Krebsforschungszentrum (DKFZ)]. I topi CCR2-DTR sono stati generati da T. Hohl (MSKCC).
Linee cellulari e sfida tumorale
La linea di melanoma B16-F10 è stata originariamente ottenuta da I. Fidler (MD Anderson Cancer Center, Houston, TX). Queste cellule sono state mantenute in RPMI 1640 contenente 7,5% siero fetale bovino (FBS) e L- glutamina. Le cellule B16-F10 sono state trasfettate con plasmide che codifica la proteina OVA a piena lunghezza per generare le cellule B16-OVA come descritto in precedenza ( 37 ). Le cellule YFP-B16 utilizzate per gli esperimenti di imaging sono state generate come descritto in precedenza ( 10 ). Le cellule tumorali sono state mantenute in RPMI 1640 contenente il 7,5% di FBS. Per le cellule B16-OVA e YFP-B16, il mezzo di crescita è stato integrato con G418 (0,5 mg / ml). Per esperimenti di sfida tumorale, 1 × 10 5le cellule B16-OVA vitali in 100 μl di salina fosfata-tamponata (PBS) sono state iniettate intradermicamente nel fianco destro dei topi C57BL / 6. Per l’analisi ex vivo di infiltrati immunitari, i topi sono stati iniettati sottocutanea con i numeri indicati di cellule tumorali ricostituite in 150 μl Matrigel (BD Biosciences) ridotto dal fattore di crescita.
In vitro attivazione di cellule OT-1 e Pmel CD8 + T
OT-1 Le cellule CD8 + T esprimono un transgene che codifica un TCR che riconosce specificamente il peptide OVA (Ser-Ile-Ile-Asn-Phe-Glu-Lys-Leu) nel contesto del mouse MHC I H-2k b ( 35 ) . Pmel-1 CD8 + T esprime un transgene che codifica un TCR che riconosce specificamente il peptide Pmel-1 (gp100) (Glu-Gly-Ser-Arg-Asn-Gln-Asp-Trp-Leu) nel contesto del mouse MHC I H-2D b ( 36 ). Le cellule T attivate OT-1 o Pmel-1 sono state generate mediante l’incubazione di splenociti del mouse peptidi-pulsati (5 × 10 6cellule / ml) in vitro per 5 a 7 giorni in presenza di IL-2. In breve, una milza del mouse è stata omogeneizzata per generare una sospensione a singola cellula e le cellule rilasciate sono state pelletate e risospese in 3 ml di tampone di lisi ACK (Lonza) per 1 min per lire i globuli rossi. Gli splenociti vennero lavati, risospesi a 5 × 10 6 cellule / ml in mezzo di crescita T cellule [RPMI 1640, penicillina (100 U / ml), streptomicina (100 mg / ml), 10% FBS, 2 mM L- glutamina, 50 μM 2-mercaptoetanolo e 1 mM piruvato di sodio] contenente peptide OVA o peptide gp100 (0,75 μg / ml) e incubato a 37 ° C in aria al 95% e 5% CO 2atmosfera umidificata. Nei giorni 3 e 5, 25 ml di terreno di crescita fresco di T cellule contenente IL-2 (20 U / ml, eBioscience) di topo ricombinante è stato aggiunto alle colture. Il giorno 7, le cellule vitali sono state purificate mediante centrifugazione a 400 g per 30 minuti a temperatura ambiente su un gradiente Histopaque (densità 1.083 Sigma-Aldrich). Questo metodo ha prodotto cellule CD8 +specifiche antigeniche che erano tra il 90 e il 95% di tetramer + per i loro rispettivi peptidi.
Saggio di uccisione del gel di collagene-fibrina
Il saggio di uccisione basata sul gel collagene-fibrina è stato precedentemente descritto in profondità ( 11 ). Abbiamo adattato questo test per esaminare l’uccisione di tumori ex 16 vivo. In breve, i topi C57BL / 6 (da 6 a 8 settimane) sono stati stimolati con tumore, con 1 × 10 5vitali B16-OVA intradermicamente sul fianco destro. I tumori sono stati tagliati il giorno 10 o 11 e disciolti in pezzi più piccoli. I tumori sono stati quindi incubati per 5 min con collagenasi (250 μg / ml) in PBS contenente Ca 2+ e Mg 2+prima di essere omogeneizzato attraverso filtri a cellule a maglia da 70 μm per generare sospensioni a cellule singole. Il numero di cellule tumorali vitali e infiltrati immunitari è stato valutato usando un emocitometro e l’esclusione di tripan blu. La frazione di immunità infiltrata all’interno dei tumori dissociati è stata confermata dalla citometria a flusso con un anticorpo anti-CD45. Cellule tumorali vitali (1 × 10 4 , insieme a tutte le cellule infiltranti) sono stati co-embedded con o senza 5 × 10 5 CD8 attivate in vitro- +cellule T in gel di collagene-fibrina (volume 0,1 ml). Come controllo per ogni esperimento, 1 × 10 4 vitali B16-OVA coltivate in vitro erano anche co-embedded con o senza 5 × 10 5 in vitro attivato CD8 +Cellule T in gel collagene-fibrin. I gel duplicati sono stati lisi quotidianamente con collagenasi e tripsina per un massimo di 3 giorni. Le cellule tumorali vitali da gel dissolte sono state diluite e placcate in piastre a sei pozzetti per la formazione della colonia. Sette giorni dopo, le piastre sono state fissate con 3,7% di formaldeide e macchiate con blu al 2% di metilene. Le colonie sono state contate manualmente per valutare il numero di cellule. Per gli esperimenti in cui le cellule CD8 + T sono state analizzate mediante citometria a flusso, i collageni-fibrin gels sono stati lisi con solo collagenasi, seguito da pipettature meccaniche per dissolvere completamente i gel e recuperare le singole cellule di sospensioni di cellule T.
Depleting T regs in vivo
In esperimenti in cui DT è stato usato per esaurire sottogruppi di cellule immunitarie in vivo, topi Foxp3-DTR e CCR2-DTR sono stati iniettati per via intraperitoneale con 45 ng di DT in 0,2 ml di PBS per l’esaurimento delle sia Foxp3 + celle o CCR2 + cellule, rispettivamente . Per tutti gli esperimenti, DT è stato somministrato il giorno 8 o 9 dopo l’inoculazione del tumore e i tumori sono stati eliminati 48 ore dopo.
Calcolo del valore per k
k è stata calcolata secondo la seguente equazione: bt = b 0 e – kpt + gt dove bt è la concentrazione delle cellule B16 nel tempo t , b 0 è la concentrazione delle cellule B16 al tempo 0, k è la costante di velocità di uccisione l’efficienza di uccisione) per le cellule CD8 + T, p è la concentrazione di cellule CD8 + T, e g è la costante di crescita per le cellule B16 ( 11 ). I valori sperimentali determinati sono stati utilizzati per calcolare k .
Purificazione di T regs
In alcuni esperimenti, i regimi di T sono stati purificati con le perle di MACS. I tumori B16-OVA sono stati eccitati il giorno 10 o 11 dopo la sfida tumorale e sono stati dissociati come descritto in precedenza. I regimi T sono stati purificati da tumori dissociati in vitro mediante separazione del tallone magnetico con il kit di isolamento cellulare T ( CD4 + CD25 + Regulatory T Miltenyi). La purezza di queste cellule è stata confermata da analisi citometrica a flusso con anticorpi coniugati con fluoroforo contro CD4, CD25 e Foxp3. In altri esperimenti, i regimi di T sono stati purificati da FACS. I topi Foxp3-GFP sono stati sfidati con 1 × 10 5 cellule tumorali B16-OVA. Il giorno 10 o 11, i tumori B16-OVA sono stati esclusi e dissociati come descritto in precedenza. T regssono state ordinate sulla base di cellule vitali CD4 + GFP + su un Cytomation MoFlo o BD FACSAria cellule di sorgente nel sistema di centraggio a flusso cytometrico MSKCC.
Analisi citometrica dei flussi di antigeni superficiali delle cellule e proteine intracellulari
Le sospensioni di cellule sono state incubate in blocco Fc (anticorpi anti-CD16 e anti-CD32, BD Biosciences) per 20 minuti in ghiaccio nel buffer FACS (PBS contenente 0,5% di albumina bovina del siero e 2 mM EDTA) prima di essere macchiati per marcatori superficiali delle cellule. I campioni sono stati incubati con anticorpi coniugati con fluoroforo contro CD4, CD8, CD25, PD-1 e TGF-β (clone 1D11) per 20-30 minuti e poi sono stati lavati tre volte con il buffer FACS. Il kit di colorazione Foxp3 (eBioscience) è stato utilizzato per la colorazione intracellulare di Foxp3 e granzyme B. Le cellule morte sono state escluse dall’analisi con il Fixable Viability Dye eFluor 506 (eBioscience). I campioni sono stati acquisiti su un citometro a flusso di LSR II a 12 colori e i dati sono stati analizzati con il software FlowJo (Tree Star).
Imaging Intravitale
I tumori YFP-B16 sono stati iniettati nel fianco sinistro dei topi WT o Foxp3-GFP a monte del LN inguinale. I topi sono stati immaginati in più punti temporali per trovare il tempo di infiltrazione massima e compensare la variabilità associata a ciascuna serie di iniezioni tumorali, risposta di priming e strutture tumorali 3D. Sette giorni dopo il trasferimento di cellule CD8 + T etichettate con fluorescenza , i topi sono stati anestetizzati con 1,5% isoflurano somministrati contemporaneamente con O 2(1 litro / min). Ogni mouse è stato quindi posizionato su una piattaforma riscaldata mantenuta a 37 ° C. La chirurgia è stata eseguita per aprire un lembo di pelle, che si estende dalle braccia anteriori all’indietro, fino alla linea midline ventrale, esponendo il tumore e LN inguinale pur mantenendo l’integrità della vasculatura. Il tumore e il TDLN sono stati quindi isolati sotto le copertine di montaggio a rondella in nylon con PBS e visualizzate con una lente d’ingrandimento a 40 × (Nikon) con acqua riscaldata (37 ° C). La temperatura dei tessuti isolati è stata controllata con una sonda termica per assicurarne la conservazione a 37 ° C. Le immagini in tempo trascorso sono state acquisite con una Z-depth in media da 100 a 150 μm con 3 μm tra le fasi, a partire da ± 10 μm dal bordo superiore delle cellule tumorali. Le immagini di mosaico sono state prese con sovrapposizioni di 50 μm tra regioni adiacenti. La velocità di cattura video di oltre 20 fps ha consentito una media di frame 6: 1 con un’area di campionamento che comprende fino a nove volumi adiacenti di 270 μm × 270 μm × 100 μm per produrre un’immagine mosaica ogni 80-120 sec. Le immagini a tempo variabile variano in lunghezza da 60 a 240 min con immagini di mosaico riprese per il più a lungo possibile.
Analisi delle immagini
Le immagini sono state analizzate con il software Volocity 4.0.2 (Improvision) e il codice MATLAB personalizzato. Le immagini di mosaico sono state compilate insieme a MATLAB prima di essere importate in Volocity. Il tracciamento delle cellule T è stato eseguito su singoli quadranti in Volocity. Le immagini sono state corrette per contrasto con il filtraggio del rumore di 3 × 3 × 3 pixel per rimuovere il segnale di sfondo dove necessario. Le tracce sono state calcolate con i moduli Volocity per l’acquisizione e il monitoraggio automatico degli oggetti e sono stati verificati per errori algoritmici. La deriva dell’immagine è stata rimossa dalle traiettorie calcolate e dalle misurazioni della velocità calcolando il movimento medio per tre punti di riferimento tumorali per immagine durante il tempo trascorso e regolando la misurazione della misurazione delle celle di conseguenza. Le posizioni delle cellule T intratumorali sono state calcolate produrre una elevata mappa digitale delle soglie delle immagini tumorali e quindi confrontando le posizioni centroidali calcolate con Volocity con la mappa tumorale per determinare la localizzazione cellulare rispetto al tumore o “non tumorale” utilizzando MATLAB. I confronti statistici di Pmel-1 con OT-1 sono stati eseguiti con il software GraphPad Prism 5 con uno studentet test.
T reg vicinanza cellulare e contatto generazione punteggio
Durante la verifica delle misure traiettorie per le cellule Pmel-1 T nei topi Foxp3-GFP, ogni cellula è stata valutata manualmente in XY e Z per interazioni con T regs . Le celle hanno ricevuto un punteggio di 1 per ogni contatto con o prossimità (entro 10 μm) ogni T reg , con interazioni aggiuntive per punto di tempo che è additivo. I punteggi sono stati normalizzati dividendo la somma delle interazioni per il numero di punti temporali per cui è stata tracciata una singola cella. I punteggi prodotti sono stati la media ponderata.
analisi statistica
Salvo diversa indicazione, tutti gli esperimenti sono stati eseguiti almeno tre volte con campioni duplicati. I dati sono stati riportati come mezzo ± SEM per il numero di esperimenti indicati. Per analisi statistiche, è stato applicato un test Kruskal-Wallis (equivalente non parametrico dell’analisi della varianza) quando vi erano più di due gruppi. Se sono stati applicati statisticamente significativi confronti coppia con test Wilcoxon e correzione Bonferroni per più comparazioni.
MATERIALI SUPPLEMENTARI
www.sciencesignaling.org/cgi/content/full/10/494/eaak9702/DC1
Sintesi delle analisi statistiche
Fig. S1. L’analisi della cellula immunitaria infiltra nei tumori da topi Foxp3-DTR trattati con DT.
Fig. S2. L’esaurimento in vivo di cellule CCR2 + nei topi CCR2-DTR non ha alcun effetto sulla soppressione dell’uccisione mediata da cellule CD8 + T da parte del microambiente tumorale.
Fig. S3. Depleting T regs ex vivo con anti-CD25 MicroBeads non ha alcun effetto sulla immunosoppressione delle cellule T CD8 + .
Fig. S4. I regimi causano alterazioni minori alla mobilità delle cellule CD8 + T nel tumore.
Fig. S5. La soppressione delle cellule T CD8 + da T regs è dipendente da contatto o da prossimità.
Fig. S6. Espressione di TGF-β e CD51 (α- V integrina) nei sottogruppi di cellule immunitarie dai tumori e splenici dei topi tumorali B16.
Fig. S7. Effetto di DT sull’espressione di PD-1 e granzyme B sulla superficie di cellule T CD8 +endogene .
Movie S1. Le cellule T CFP-Pmel si trovano in regioni altamente infiltrate da T regs .
Movie S2. Le cellule T CFP-Pmel si trovano in prossimità o contattano con T regs .
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