“Non è da escludere origine da laboratorio” la nuova ricerca dall’Università di Insbruck su SARS ‐ CoV-2

Rossana Segreto – Università di Insbruck

“L’origine della sindrome respiratoria acuta grave ‐ coronavirus (SARS ‐ CoV) ‐2 è ancora controversa. Le analisi genomiche mostrano che SARS ‐ CoV ‐ 2 è probabile che sia chimerico, la maggior parte della sua sequenza più vicina al pipistrello CoV RaTG13, mentre il suo dominio di legame al recettore (RBD) è quasi identico a quello di un Pangolino CoV. I virus chimerici possono sorgere tramite ricombinazione naturale o intervento umano” questo il testo di presentazione di un nuovo studio pubblicato su onlinelibrary.wiley.com da due ricercatori – Rossana Segreto e Yuri Deigin, rispettivamente  dell’Università di Insbruck e dell’azienda Youthereum Genetics – che prosegue così:

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“Il sito di scissione della furina nella proteina spike di SARS ‐ CoV ‐ 2 conferisce al virus la capacità di attraversare le barriere delle specie e dei tessuti, ma in precedenza non era stato visto in altri CoV simili alla SARS. Potrebbero essere state eseguite manipolazioni genetiche per valutare i pangolini come possibili ospiti intermedi per CoV derivati ​​da pipistrelli che originariamente non erano in grado di legarsi ai recettori umani? Sia il sito di scissione che il RBD specifico potrebbero derivare dalla mutagenesi sito-diretta, una procedura che non lascia traccia. Considerando l’impatto devastante della SARS ‐ CoV ‐ 2 e l’importanza di prevenire future pandemie, i ricercatori hanno la responsabilità di effettuare un’analisi approfondita di tutte le possibili origini della SARS ‐ CoV ‐ 2”. Il report dello studio, quindi, continua la sua analisi:

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È passato quasi un anno dallo scoppio della sindrome respiratoria acuta grave ‐ coronavirus 2 (SARS ‐ CoV ‐ 2) a Wuhan, in Cina, e la sua origine è ancora controversa. Nonostante lo sforzo di ricerca internazionale condotto, un ospite naturale, diretto o intermedio, non è stato ancora identificato. L’ipotesi che il mercato all’ingrosso Wuhan Huanan frutti di mare è stata la prima fonte di trasmissione del virus animale-umano ora è stato definitivamente respinto i ed i pochi campioni di mercato che sono stati raccolti hanno mostrato solo adattato agli esseri umani SARS-CoV-2, senza tracce di predecessore zoonotici ceppi ii . Quasi tutti gli articoli scientifici pubblicati fino ad oggi affermano che SARS ‐ CoV ‐ 2 ha un’origine naturale e l’unico documento pubblicato che considera possibile un’origine di laboratorio 1 ]si concentra sul passaggio seriale come tecnica che potrebbe giustificare l’adattamento speciale della SARS ‐ CoV ‐ 2 alle cellule umane. Descriviamo qui come le due principali caratteristiche di SARS ‐ CoV ‐ 2, (1) la presenza di un sito di scissione della furina mancante in altri CoV dello stesso gruppo e (2) un dominio di legame del recettore (RBD) ottimizzato per legarsi alle cellule umane 2 ] potrebbe essere il risultato di tecniche di manipolazione di laboratorio come la mutagenesi sito-diretta. È meno probabile che l’acquisizione di entrambe le caratteristiche uniche da parte di SARS ‐ CoV ‐ 2 più o meno simultaneamente sia naturale o causata solo dal passaggio seriale cellula / animale”.

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Rossana Segreto

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Zhou et al. 3 ]  dell’Istituto di virologia di Wuhan (WIV) sono stati i primi a identificare e caratterizzare un nuovo coronavirus (CoV), SARS ‐ CoV ‐ 2. Le sequenze genomiche ottenute dai primi casi condividevano l’identità di sequenza del 79% con i CoV che hanno causato la sindrome respiratoria acuta grave (SARS ‐ CoV) nel 2002-2003 e l’identità di sequenza del 96,2% con RaTG13 (MN996532), una sequenza CoV rilevata da un pipistrello Rhinolophus affinis . RaTG13 è attualmente il parente filogenetico più vicino per SARS ‐ CoV ‐ 2 trovato, 4 ] ma la sua sequenza genomica completa non è stata pubblicata prima dello scoppio di SARS ‐ CoV ‐ 2 e il campione originale è stato raccolto nella provincia dello Yunnan (Cina) dal stesso gruppo di ricercatori WIV nel 2013. Zhou et al. [3 ] hanno affermato di aver trovato una corrispondenza tra SARS ‐ CoV ‐ 2 e una breve regione di RNA polimerasi RNA dipendente (RdRp) di un CoV nel loro database e quindi hanno sequenziato completamente il campione originale raccolto nel 2013, che hanno chiamato RaTG13.

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Abbiamo scoperto che il RdRp di RaTG13 ha un’identità nucleotidica del 100% con la sequenza BtCoV / 4991 (KP876546), che è stata identificata da Ge et al. 5 ] in un pipistrello Rhinolophus affinis nella provincia dello Yunnan nel 2013, stesso luogo e anno del RaTG13. BtCoV / 4991 è stato raccolto in una miniera colonizzata da pipistrelli vicino a Tongguanzhen, Mojiang, Yunnan. I ricercatori del WIV sono stati invitati a indagare sulla miniera dopo che sei minatori avevano contratto una grave polmonite nel 2012 iii e tre dei minatori sono morti. 6 ] I minatori sono stati incaricati di ripulire gli escrementi di pipistrello dalla miniera e la gravità della loro polmonite era correlata alla durata dell’esposizione alla miniera. 7] Quattro campioni di minatori sono stati successivamente sottoposti a test presso il WIV, dove sono stati identificati gli anticorpi dell’immunoglobulina G (IgG) contro la SARS in tutti i campioni. 8 ] Considerando che solo circa 5300 persone sono state infettate nella Cina continentale durante l’epidemia di SARS del 2002-2004, la maggior parte delle quali risiedeva a Guandong, le probabilità che quattro minatori nello Yunnan trattenessero gli anticorpi dall’epidemia di SARS del 2002-2004 sono trascurabili. D’altra parte, è possibile che il test degli anticorpi SARS somministrato ai minatori abbia reagito in modo incrociato con un nuovo virus pipistrello simile alla SARS che i minatori avevano acquisito nella miniera. Ge et al. 5 ] hanno identificato un numero di CoV nella miniera, ma sulla base dell’analisi filogenetica, BtCoV / 4991 era l’unico ceppo correlato alla SARS, chiaramente separato da tutti i CoV alfa e beta conosciuti a quel tempo. BtCoV / 4991 era anche diverso da altri CoV di pipistrello nell’analisi filogenetica effettuata da Wang et al. nel 2019. 9 ] Chen et al. 10 ] ha  identificato BtCoV / 4991 come la sequenza più vicina a SARS ‐ CoV ‐ 2 perché RaTG13 non era ancora stato pubblicato a quel tempo. In seguito è stato affermato che BtCoV / 4991 e RaTG13 sono due diversi nomi di codifica dello stesso ceppo, poiché i loro autori originali al WIV hanno registrato i due ceppi come una voce nel Database of Bat-associated Viruses (DBatVir). iv

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Alla fine di luglio 2020, Zhengli Shi, il principale ricercatore CoV di WIV, in un’intervista via e-mail 11 ] ha affermato la ridenominazione del campione RaTG13 e ha dichiarato inaspettatamente che il sequenziamento completo di RaTG13 è stato effettuato nel 2018 dopo l’epidemia di SARS ‐ CoV ‐ 2, come affermato in Zhou et al. 3 ]  L’inversione della posizione di WIV su quando esattamente RaTG13 è stato completamente sequenziato potrebbe essere stato dovuto alla scoperta da parte di ricercatori indipendenti sulle origini di SARS ‐ CoV ‐ 2 che i nomi dei file del sequenziamento grezzo leggono depositati da WIV il 19 maggio 2020 v sembrano indicare che il sequenziamento per RaTG13 è stato eseguito nel 2017 e nel 2018. vi Tuttavia, nessun errore formale sull’anno di sequenziamento e ridenominazione del campione dagli autori di Zhou et al. 3 ] è ancora apparso, o per quanto è attualmente noto, è stato presentato.

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La seconda sequenza RdRp non umana più vicina a BtCoV / 4991 (91,89% di identità nucleotidica) è la sequenza CoV MP789 (MT084071) isolata nel 2019 in un pangolino malese ( Manis javanica ) dalla provincia del Guangdong (GD), Cina. 12 ] La proteina dell’involucro di MP789 mostra sorprendentemente un’identità amminoacidica del 100% con la proteina corrispondente in RaTG13, in bat ‐ SL ‐ CoVZXC21 (MG772934.1), in bat ‐ SL ‐ CoVZC45 (MG772933.1) e in alcuni primi SARS‐ CoV ‐ 2 isolati (ad esempio YP_009724392). 13 ] La proteina dell’involucro dei CoV è coinvolta in aspetti critici del ciclo di vita virale, come l’ingresso virale, la replicazione e la patogenesi. 14 ]

I BAT COV SONO STATI APPROFONDITI STUDIATI E GENETICAMENTE MANIPOLATI

Molti studi hanno riportato che i pipistrelli sono serbatoi naturali per un’ampia varietà di CoV potenzialmente patogeni simili alla SARS. 15 , 16 ] Alcuni di questi virus possono potenzialmente infettare direttamente gli esseri umani 17 ] , mentre altri devono mutare la loro proteina spike per legarsi efficacemente al recettore dell’enzima 2 di conversione dell’angiotensina 1 (hACE2) umano e mediare l’ingresso del virus. 18 ]Per valutare il potenziale di emergenza di nuovi CoV, i ricercatori hanno creato una serie di CoV chimerici, costituiti da spine dorsali di CoV di pipistrello, normalmente incapaci di infettare le cellule umane, le cui proteine ​​spike sono state sostituite da quelle di CoV compatibili con l’ACE2 umano. Queste chimere avevano lo scopo di simulare eventi di ricombinazione che potrebbero verificarsi in natura. 19 , 20 ] Tali esperimenti di guadagno di funzione hanno sollevato una serie di preoccupazioni sulla biosicurezza e suscitato polemiche tra i ricercatori e il grande pubblico. Uno dei principali argomenti a favore degli studi sul guadagno di funzione è la necessità di essere preparati con un arsenale di farmaci e vaccini per la prossima pandemia. 21 ]Al contrario, uno dei principali argomenti contro di loro è che la prossima pandemia stessa potrebbe essere causata da quegli esperimenti, a causa del rischio di fuga dal laboratorio. 22 , 23 ]

Negli ultimi anni, il campo della corona ‐ virologia si era concentrato sulle terapie e sui vaccini pan ‐ CoV, come risulta evidente dalle ricerche condotte negli ultimi 5 anni, 24 – 27 ] e dai resoconti dei media. vii La generazione sintetica di pannelli diversificati di potenziali CoV pre ‐ emergenti è stata dichiarata un obiettivo di sovvenzioni attive per l’EcoHealth Alliance, che ha finanziato alcune di queste ricerche presso WIV, in collaborazione con laboratori negli Stati Uniti e altri partner internazionali. viii

LA CREAZIONE DI COPERTURE CHIMERICHE CON NUOVI RBDS È ANDATA SUCCESSIVA DA DECENNI

I ricercatori generano CoV chimerici da oltre due decenni, molto prima dell’avvento delle moderne tecniche di sequenziamento o di ingegneria genetica. Ad esempio, nel 1999, un gruppo dell’Università di Utrecht ha utilizzato la ricombinazione mirata dell’RNA per creare una chimera CoV “gatto e topo”: gli RBD di un CoV felino e murino sono stati scambiati, dimostrando che questo scambio ha scambiato anche il tropismo delle specie durante il periodo in vitro esperimenti. 28 ]

Nel 2007, il gruppo Shi del WIV ha creato una serie di proteine ​​spike chimeriche CoV “bat-man” mentre cercava di determinare cosa conferisse esattamente ai CoV la capacità di saltare da una specie all’altra. I ricercatori hanno utilizzato diversi segmenti della proteina spike del virus della SARS umana per sostituire i segmenti corrispondenti nella proteina spike di una spina dorsale virale di pipistrello. Si è concluso che una regione relativamente breve (da 310 aa 518) della proteina spike “era necessaria e sufficiente per convertire Rp3 ‐ S in una molecola legante huACE2” 29, ovvero fornire alla proteina spike bat CoV una nuova capacità di legarsi a un recettore ACE2 umano.

Nel 2008, il gruppo Baric dell’Università della Carolina del Nord (UNC) ha portato la ricerca WIV un ulteriore passo avanti: invece di utilizzare pseudo-virus dei virus dell’immunodeficienza umana (HIV) con proteine ​​spike di Bat CoV, è stato creato un CoV chimerico vivo. A seguito degli esperimenti dei loro colleghi WIV del 2007, il gruppo Baric ha utilizzato un CoV di pipistrello simile alla SARS come spina dorsale e ha sostituito il suo RBD con il RBD della SARS umana. 30 ]

Nel 2015, i gruppi Shi e Baric hanno unito le forze e hanno pubblicato probabilmente il più famoso documento di virologia per guadagno di funzione, che descriveva la creazione di un altro virus chimerico sintetico. 19 ] Questa volta l’RBD di una spina dorsale SARS adattata ai topi (SARS-MA15) è stato sostituito dall’RBD di RsSHC014, un ceppo di pipistrelli precedentemente isolato dai pipistrelli dello Yunnan nel 2011 dal gruppo Shi. Nel 2016, il gruppo Baric ha ripetuto il loro esperimento del 2015 utilizzando la stessa spina dorsale SARS-MA15 e RBD da Rs3367, 31 ] un parente stretto di RsSHC014 anche lui precedentemente trovato nello Yunnan da WIV e ribattezzato “WIV1” dopo la coltura dal vivo. 17 ]

Probabilmente il maggior numero riportato di nuovi virus chimerici creati è stato descritto in un documento del 2017 del gruppo Shi del WIV, 15 ] in cui gli autori hanno riferito di aver creato otto virus chimerici utilizzando WIV1 come spina dorsale e trapiantando in esso vari RBD da pipistrello SARS come i virus. Questi virus sono stati raccolti nell’arco di 5 anni dalla stessa grotta vicino a Kunming, nella provincia dello Yunnan, dove il gruppo Shi aveva originariamente trovato Rs3367 e RsSHC014. Solo due degli otto virus chimerici vivi sono stati salvati con successo e si è scoperto che quei due ceppi possiedono la capacità di legarsi al recettore ACE2 umano, come confermato da esperimenti su cellule HeLa che esprimono hACE2 e quantificazione RT ‐ PCR dell’RNA virale.

SARS ‐ COV ‐ 2 CONDIVIDE IL SUO RBD CON UNA COV PANGOLIN

La possibilità che i pangolini possano essere l’ospite intermedio per SARS ‐ CoV ‐ 2 è stata a lungo discussa. 32 – 34 ] La più grande divergenza tra SARS ‐ CoV ‐ 2 e RaTG13 si osserva nella RBD delle loro proteine ​​spike. 4 ] Sebbene la sua somiglianza genomica complessiva sia inferiore a SARS ‐ CoV ‐ 2 rispetto a quella di RaTG13, il ceppo di pangolino MP789 isolato dai pangolini GD ha un RBD quasi identico a quello di SARS ‐ CoV ‐ 2. Infatti, pangolino CoVs e SARS ‐ CoV ‐ 2 possiedono amminoacidi identici nei cinque residui critici del RBD, mentre RaTG13 condivide solo un amminoacido con SARS ‐ CoV ‐ 2. 35 ]La somiglianza di sequenza ACE2 è maggiore tra umani e pangolini che tra umani e pipistrelli. Curiosamente, la proteina spike di SARS ‐ CoV ‐ 2 ha un’affinità di legame prevista più alta per il recettore ACE2 umano rispetto a quella di pangolini e pipistrelli. ix Prima dell’epidemia di SARS ‐ CoV ‐ 2, i pangolini erano gli unici mammiferi oltre ai pipistrelli documentati per trasportare ed essere infettati da CoV correlato a SARS ‐ CoV ‐ 2. 12 ]Eventi di ricombinazione tra RBD di CoV da pangolini e spina dorsale simile a RaTG13 potrebbero aver prodotto SARS ‐ CoV ‐ 2 come ceppo chimerico. Affinché tale ricombinazione avvenga naturalmente, i due virus devono aver infettato simultaneamente la stessa cellula nello stesso organismo, un evento piuttosto improbabile considerando la bassa densità di popolazione dei pangolini e la scarsa presenza di CoV nelle loro popolazioni naturali. x Inoltre, studi sul legame recettoriale del RaTG13 ricostituito hanno dimostrato che non si lega al pangolino ACE2. xi

IL SITO DELLA SCISSIONE DI FURIN: LA DIFFERENZA CHIAVE TRA SARS ‐ COV ‐ 2 E IL SUO RATG RELATIVO PIÙ VICINO13

SARS ‐ CoV ‐ 2 differisce dal suo parente più prossimo RaTG13 per alcune caratteristiche chiave. La differenza più evidente è l’acquisizione nella proteina spike di SARS ‐ CoV ‐ 2 di un sito di scissione attivato da un enzima della cellula ospite furin, precedentemente non identificato in altri beta ‐ CoV della linea b 36 ] e simile a quello di Middle Coronavirus della sindrome respiratoria orientale (MERS). 35 ] L’elaborazione della proteasi ospite gioca un ruolo fondamentale come barriera di specie e tessuti e l’ingegnerizzazione dei siti di scissione delle proteine ​​spike CoV modifica il tropismo e la virulenza del virus. 37 ]L’onnipresente espressione di furina in diversi organi e tessuti ha conferito alla SARS ‐ CoV ‐ 2 la capacità di infettare organi solitamente invulnerabili ad altri CoV, portando a infezioni sistemiche nel corpo. 38 ] La SARS ‐ CoV ‐ 2 coltivata in cellule che mancava del sito di scissione sopra menzionato ha causato sintomi attenuati nei criceti infetti, 39 ] e studi di mutagenesi hanno confermato che il sito della furina polibasica è essenziale per SARS ‐ CoV ‐ 2 capacità di infettare le cellule polmonari umane. 40 ]

Il sito polibasico della furina in SARS ‐ CoV ‐ 2 è stato creato da un inserto a 12 nucleotidi TCCTCGGCGGGC che codifica per una sequenza di amminoacidi PRRA alla giunzione S1 / S2 (Figura  1 ). È interessante notare che le due arginine congiunte sono codificate da due codoni CGGCGG, che sono rari per questi virus: solo il 5% delle arginine è codificato da CGG in SARS ‐ CoV ‐ 2 o RaTG13, e CGGCGG nel nuovo inserto è l’unica istanza doppia di questo codone in SARS ‐ CoV ‐ 2. L’inserto CGGCGG include un sito con restrizioni Fau I, di cui ci sono sei casi in SARS ‐ CoV ‐ 2 e quattro casi in RaTG13 (e due in MP789). La fortuita ubicazione del sito Fau I potrebbe consentire l’uso di tecniche di polimorfismo della lunghezza dei frammenti di restrizione (RFLP) 41 ] per la clonazione [42 ]o lo screening per le mutazioni,[ 43 ]poiché il nuovo sito della furina è soggetto a delezioniin vitro. [ 39 , 44 ]

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Sequenza nucleotidica della proteina S alla giunzione S1 / S2 in SARS ‐ CoV ‐ 2 (NC045512.2) che mostra il sito di scissione della furina (in blu) che include un sito di restrizione enzimatica FauI

Uno studio di Zhou et al. 45 ] hanno  riportato la scoperta di un nuovo ceppo CoV RmYN02, che secondo gli autori presenta inserzioni di amminoacidi PAA naturali nel sito di scissione S1 / S2 dove SARS ‐ CoV ‐ 2 ha l’inserzione PRRA. Tuttavia, dopo un attento esame della sequenza nucleotidica sottostante di RmYN02 rispetto ai suoi antenati più vicini bat ‐ SL ‐ CoVZC45 e bat ‐ SL ‐ CoVZXC21, non sono evidenti inserimenti, solo mutazioni nucleotidiche (Figura  2 ).

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Allineamento delle sequenze nucleotidiche e amminoacidiche della proteina S da bat ‐ SL ‐ CoVZC45 (MG772933.1) e RmYN02 nel sito di giunzione S1 / S2. Non si possono osservare inserimenti di nucleotidi che possono evolversi in un sito di scissione della furina (in blu)

Pertanto, SARS ‐ CoV ‐ 2 rimane unico tra i suoi parenti beta CoV non solo a causa di un sito di furina polibasica alla giunzione S1 / S2, ma anche a causa dell’inserto di quattro amminoacidi PRRA che lo aveva creato. L’inserimento provoca una divisione nel codone originale per la serina (TCA) in MP789 o RaTG13 per dare parte di un nuovo codone per serina (TCT) e parte dell’amminoacido alanina (GCA) in SARS ‐ CoV ‐ 2 (Figura  3 ) .

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Allineamento delle sequenze nucleotidiche e amminoacidiche della proteina S da RaTG13 (MN996532), MP789 (MT084071) e SARS ‐ CoV ‐ 2 (NC045512.2) nel sito S1 / S2. I nucleotidi e gli amminoacidi comuni sono indicati in nero, i nucleotidi unici SARS ‐ CoV ‐ 2 e gli amminoacidi in rosso, i nucleotidi e gli amminoacidi unici RaTG13 in verde e i nucleotidi e gli amminoacidi comuni in SARS ‐ CoV ‐ 2 e RaTG13 che differiscono in MP789 in blu. Il codone forserine (TCA) in RaTG13 e MP789 è suddiviso in SARS ‐ CoV ‐ 2 per fornire parte di un nuovo codon forserine (TCT) e parte dell’amminoacidalanina (GCA)

L’inserimento del sito di scissione della furina in SARS ‐ CoV ‐ 2 non è in frame con il resto della sequenza, se confrontato con le sequenze MP789 e RaTG13 (Figura  3 ). Pertanto, è possibile escludere che tale inserimento possa aver avuto origine dallo slittamento della polimerasi o dal rilascio e readescamento, poiché sono state postulate mutazioni di inserzione generate da questi meccanismi per mantenere il frame di lettura della sequenza virale. 46 ] La possibilità che il sito di scissione della furina possa essere stato acquisito mediante ricombinazione è stata recentemente messa in dubbio da Seyran et al., 47 ] perché la proteina spike SARS ‐ CoV ‐ 2 sembra mancare di ulteriori eventi di ricombinazione in contrasto con il modello di ricombinazione di altri CoV.

CRITICA DELLA “ORIGINE PROSSIMALE DELLA SARS ‐ COV ‐ 2”

A causa dell’ampio spettro di ricerche condotte in quasi 20 anni sui SARS ‐ CoV di pipistrello giustificate dal loro potenziale di propagarsi da animale a umano 48 ], non si può escludere una possibile origine sintetica da parte dell’ingegneria di laboratorio della SARS ‐ CoV ‐ 2. L’articolo ampiamente citato di Andersen et al. 2 ] ha  affermato che SARS ‐ CoV ‐ 2 ha molto probabilmente un’origine naturale. L’argomento principale portato dagli autori è che il legame ad alta affinità della proteina spike SARS ‐ CoV ‐ 2 a hACE2 non avrebbe potuto essere previsto da modelli basati sul RBD di SARS ‐ CoV. Sulla base dell’analisi strutturale condotta da Wan et al., 49 ] SARS ‐ CoV ‐ 2 ha il potenziale per riconoscere hACE2 in modo più efficiente rispetto al SARS ‐ CoV, emerso nel 2002. Inoltre, la generazione di ceppi chimerici CoV ha recentemente dimostrato che i picchi di CoV di pipistrello possono legarsi al recettore hACE2 con maggiore plasticità di quanto previsto in precedenza . 15 ] Tutti gli amminoacidi nel RBD sono stati ampiamente analizzati e sono disponibili nuovi modelli per prevedere l’affinità ACE2. 50 ] A questo proposito, BatCoV Rs3367 (99,9% di identità rispetto a WIV1) ha dimostrato di condividere con SARS ‐ CoV ‐ 2 quattro dei sei residui critici nell’RBD. Considerando che è stato dimostrato che WIV1 si lega direttamente a hACE2, la stessa ipotesi si sarebbe potuta facilmente fare per SARS ‐ CoV ‐ 2 RBD. 51 ]

Come descritto sopra, negli anni è stata realizzata la creazione di virus chimerici con lo scopo di studiare la potenziale patogenicità dei CoV pipistrelli per l’uomo. In questo contesto, SARS ‐ CoV ‐ 2 avrebbe potuto essere sintetizzato combinando uno scheletro simile a RaTG13 con il RBD di CoV simile a quello recentemente isolato dai pangolini 12 ] , perché quest’ultimo è caratterizzato da una maggiore affinità con il recettore hACE2 . Tale ricerca avrebbe potuto mirare a identificare i pangolini come possibili ospiti intermedi per bat-CoV potenzialmente patogeni per l’uomo. Il successivo passaggio seriale di cellule o animali, come descritto da Sirotkin e Sirotkin 1 ], potrebbe aver fornito il perfetto adattamento del RBD all’hACE2.

Per quanto riguarda il sito di scissione della pelliccia, Andersen et al. 2 ]  affermano che “la conseguenza funzionale del sito di scissione polibasica in SARS-CoV-2 è sconosciuta”. Nuovi studi di diversi gruppi hanno recentemente identificato questo sito di attivazione come possibile che consente al virus di diffondersi in modo efficiente tra gli esseri umani e attaccare più organi. 52 ] Gli esperimenti sulla scissione proteolitica delle proteine ​​spike di CoV sono stati recentemente suggeriti come futuri studi chiave per comprendere la trasmissibilità del virus in diversi ospiti. 50 ]

Andersen et al. 2 ]  affermano inoltre, sulla base del lavoro di Almazan et al. 53 ]  che “i dati genetici mostrano inconfutabilmente che SARS ‐ CoV ‐ 2 non è derivato da alcuna spina dorsale di virus precedentemente utilizzata.” Negli ultimi 6 anni prima dello scoppio della SARS ‐ CoV ‐ 2, il numero di potenziali spine dorsali dei pipistrelli è stato innegabilmente aumentato da diversi screening CoV dei pipistrelli, portando il RaTG13 all’attenzione scientifica nel gennaio 2020. Anche altre possibili spine potrebbero farlo. , ancora in attesa di pubblicazione.

Andersen et al. 2 ]  affermano che “l’acquisizione sia del sito di scissione polibasica che dei glicani O-linked predetti è anche contro gli scenari basati sulla cultura”. I metodi per l’inserimento di un sito di scissione polibasica nella bronchite infettiva CoV sono forniti in Cheng et al. 54 ]  e ha provocato una maggiore patogenicità. Per quanto riguarda i glicani O ‐ legati previsti intorno al sito polibasico appena inserito, va notato che questa previsione non è stata confermata dall’indagine Cryo ‐ EM sulla glicoproteina spike SARS ‐ CoV ‐ 2. 55 ] Tuttavia, sebbene sia vero che i glicani O ‐ legati hanno molte più probabilità di insorgere sotto selezione immunitaria, potrebbero essere aggiunti in laboratorio attraverso la mutagenesi sito-diretta56 ] o sorgono nel corso di esperimenti in vivo , ad esempio, in topi BLT-L con impianti polmonari umani e sistema immunitario umano autologo 57 ] o in topi che esprimono il recettore hACE2. 31 ] Per superare i problemi di isolamento del CoV del pipistrello, sono stati condotti esperimenti basati sull’inoculazione diretta del CoV del pipistrello nei ratti allattati. 58 ] Topi umanizzati, furetti, primati e / o altri animali con conformazione ACE2 simile avrebbero potuto essere utilizzati per esperimenti di passaggio seriale, come descritto in dettaglio da Sirotkin e Sirotkin. 1 ]

Andersen et al. 2 ]  affermano anche che “la successiva generazione di un sito di scissione polibasica avrebbe richiesto il passaggio ripetuto in colture cellulari o animali con recettori ACE2 simili a quelli umani, ma tale lavoro non è stato descritto in precedenza”. Non si dovrebbe escludere che tali esperimenti possano essere stati interrotti a causa dell’epidemia di SARS ‐ CoV ‐ 2, prima di una possibile pubblicazione dei risultati o che i risultati non fossero mai destinati a essere pubblicati.

È importante menzionare che RaTG13 e le sequenze CoV del pangolino da pangolini di contrabbando confiscati nella provincia GD nel marzo 2019 e a cui si riferiscono la maggior parte dei documenti pubblicati a sostegno di un’origine naturale della SARS ‐ CoV ‐ 2, 2 ] sono stati recentemente interrogati per quanto riguarda l’accuratezza dei dati di assemblaggio xii e richiedono ulteriori analisi per dimostrare la loro correttezza. xiii xiv ] Va anche notato che studi in vitro sul legame del recettore di RaTG13 ricostituito hanno prodotto alcuni risultati peculiari. [xi] L’osservazione più sorprendente è stata che RaTG13, a differenza di SARS ‐ CoV ‐ 2, non è in grado di legare ACE2 in R. macrotis pipistrelli, un parente stretto del presunto ospite di RaTG13, R. affinis 59 ] (il cui recettore ACE2 non è stato ancora testato). Allo stesso tempo, è stato osservato che RaTG13 si lega a hACE2 60 ] , ma non così come ACE2 di ratti e topi, a cui SARS ‐ CoV ‐ 2 non si lega affatto. È possibile che proprio come SARS-MA15 era un ceppo di SARS adattato al topo, RaTG13 è in realtà una versione adattata al topo di un CoV estratto dalla grotta di Mojiang, piuttosto che un ceppo ottenuto da un tampone fecale di pipistrello? Sfortunatamente, il campione RaTG13 è stato esaurito e non è più disponibile per l’esame esterno, 11 ]il che è un peccato dato un numero di incongruenze nella sequenza dei dati grezzi. Inoltre, lo stato e la disponibilità dei campioni dei minatori del Mojiang rimangono anch’essi una questione aperta e di grande rilevanza. Diversi campioni dai minatori sono stati raccolti 7 , 8 ] e probabilmente conservati, e sarebbe di grande valore testarli per la presenza di CoV simili a SARS ‐ CoV ‐ 2.

Un’altra questione aperta è il motivo della modifica e della successiva cancellazione del database virale di WIV. Nel maggio 2020, diversi media hanno riferito che il sistema di tracciamento delle modifiche del database interno di WIV ha mostrato che il database è stato rinominato da “database di agenti patogeni virali trasmessi dalla fauna selvatica” in “database di patogeni virali trasmessi da pipistrelli e roditori” e la sua descrizione è stata modificata sostituire le istanze di “animale selvatico” con “pipistrello e roditore”; è stata inoltre eliminata la menzione di “vettori artropodi”. xv La descrizione del database riportava che conteneva oltre 60 Mb di dati in formato SQL (Structured Query Language), ma all’inizio di maggio 2020 il link per il download non funzionava più. xvi Successivamente, la pagina del database è stata completamente rimossa ma la sua istantanea è ancora disponibile su Web Archive.xvii È possibile che altri laboratori CoV internazionali abbiano scaricato l’archivio SQL del database WIV prima che fosse rimosso, nel qual caso tali gruppi dovrebbero rendere quei dati pubblicamente disponibili.

COME HA POTUTO IL VIRUS ESSERE SCAPPATO DA UN LABORATORIO?

La fuoriuscita di agenti patogeni altamente pericolosi dai laboratori non è un evento raro e gli eventi sono stati documentati in diversi paesi. La perdita di laboratorio più notevole conosciuta è la fuga dal laboratorio H1N1 del 1977 dalla Cina che ha causato una pandemia mondiale. 61 ] Il più recente è l’epidemia di brucellosi del novembre 2019 che si è verificata in due centri di ricerca a Lanzhou, in Cina, infettando oltre 100 studenti e membri del personale. 62 ] Sono stati segnalati anche diversi casi di fuga in laboratorio del primo virus della SARS: nell’estate del 2003 a Singapore, 63 ] poi nel dicembre 2003 a Taiwan, xviii e nella primavera del 2004 due volte in Cina. xix

Le preoccupazioni sulla sicurezza del laboratorio del WIV sono state sollevate nel 2018 dai funzionari dell’ambasciata degli Stati Uniti dopo aver visitato l’Istituto e aver avuto un’intervista con Zhengli Shi. Gli auditor del laboratorio hanno riassunto le loro preoccupazioni in successivi cablogrammi diplomatici a Washington. xx Gli esperti cinesi hanno anche sollevato preoccupazioni sulla sicurezza dei laboratori nel loro paese, lamentando che “i rifiuti di laboratorio possono contenere virus, batteri o microbi prodotti dall’uomo” e che “alcuni ricercatori scaricano materiali di laboratorio nelle fogne dopo esperimenti senza uno specifico meccanismo biologico di smaltimento . ” xxi

Anche i laboratori americani hanno avuto la loro parte di problemi di sicurezza. Recentemente, le operazioni di ricerca nella struttura di livello di biosicurezza (BSL) ‐4 United States Army Medical Research Institute of Infectious Diseases (USAMRIID) a Fort Detrick sono state interrotte nell’agosto 2019 a seguito di violazioni della sicurezza, in particolare, relative allo smaltimento di materiali infettivi. xxii Sono stati citati anche altri laboratori statunitensi per problemi di sicurezza. 22 ]

È possibile ipotizzare una serie di scenari che causano la fuoriuscita di SARS ‐ CoV ‐ 2 da un laboratorio. Ad esempio, un animale infetto potrebbe essere scappato da un laboratorio o potrebbe aver graffiato o morso un lavoratore (una preoccupazione sollevata nel 2017 circa l’istituzione di una struttura per test sui vaccini per primati BSL-4 a Kunming, Yunnan 64 ] ), o un il ricercatore potrebbe essersi bloccato accidentalmente con l’inoculo (come è successo in due casi in Russia xxiii ). Fino al 2020, i CoV non erano considerati particolarmente letali o virulenti. I CoV simili alla SARS non richiedevano BSL ‐ 4 e potevano essere manipolati in condizioni BSL ‐ 2 e BSL ‐ 3 42 ] , rendendo più probabile una perdita accidentale. Esperimenti con aerosol con CoV 65 ]potrebbe causare anche perdite di laboratorio, perché un guasto all’apparecchiatura utilizzata potrebbe passare inosservato per molto tempo prima che venga rilevata l’infezione dei lavoratori di laboratorio. Infine, il virus potrebbe potenzialmente essere trapelato attraverso il sistema fognario se non fossero state seguite le corrette procedure di smaltimento e / o decontaminazione dei rifiuti.

CONCLUSIONI E PROSPETTIVE

Sulla base della nostra analisi, un’origine artificiale della SARS ‐ CoV ‐ 2 non è una teoria del complotto priva di fondamento che deve essere condannata 66 ] ei ricercatori hanno la responsabilità di considerare tutte le possibili cause dell’emergenza della SARS ‐ CoV ‐ 2. L’inserimento di Pangolino CoV RBD adattato all’uomo ottenuto mediante passaggio seriale cellula / animale e sito di scissione della furina potrebbe derivare da esperimenti di mutagenesi sito-diretta, in un contesto di studi evolutivi o sviluppo di vaccini o farmaci pan-CoV. Un recente articolo su Nature 67 ]afferma che un’origine di laboratorio per SARS ‐ CoV ‐ 2 non può essere esclusa, poiché i ricercatori potrebbero essere stati infettati accidentalmente e che gli esperimenti di guadagno di funzione che hanno portato alla SARS ‐ CoV ‐ 2 avrebbero potuto essere eseguiti presso WIV. La manipolazione genetica della SARS ‐ CoV ‐ 2 potrebbe essere stata eseguita in qualsiasi laboratorio al mondo con accesso alla sequenza della spina dorsale e alle attrezzature necessarie e non avrebbe lasciato traccia. Le moderne tecnologie basate su piattaforme di genetica sintetica consentono la ricostruzione dei virus in base alla loro sequenza genomica, senza la necessità di un isolato naturale. 68 ]

È urgentemente necessaria un’indagine approfondita sulle raccolte di ceppi e sui record di ricerca in tutti i laboratori coinvolti nella ricerca sul CoV prima dell’epidemia di SARS ‐ CoV ‐ 2. Particolare attenzione dovrebbe essere prestata ai ceppi di CoV che sono stati generati nei laboratori di virologia ma non sono ancora stati pubblicati, come quelli eventualmente descritti nel database WIV cancellato. Poiché la ricerca di un possibile ospite naturale potrebbe richiedere anni, come con la prima SARS, 67 ] o non riuscire mai, la stessa priorità dovrebbe essere data allo studio delle origini naturali e di laboratorio della SARS ‐ CoV ‐ 2.

Xiao Qiang, un ricercatore di Berkeley, ha recentemente affermato: “Per capire esattamente come si è originato questo virus è una conoscenza fondamentale per evitare che ciò accada in futuro”. [xxi]

RICONOSCIMENTI

Siamo molto grati al Prof. Allan Krill (NTNU) per la correzione di bozze del manoscritto, per tutti i preziosi commenti e per l’apertura mentale sulle ipotesi controverse; Il Prof. Heribert Insam (Capo del Dipartimento di Microbiologia; Università di Innsbruck) per il suo supporto e il Dr. Lawrence Sellin per tutte le informazioni utili. Un ringraziamento speciale va al Dr. Fernando Castro ‐ Chavez (ex Post ‐ Doc presso il New York Medical College) per il suo supporto con Research Gate. Siamo molto grati a René Bergelt, per aver scoperto il database che ha confermato la nostra scoperta che BtCoV4991 e RaTG13 si riferiscono allo stesso campione. Infine, siamo estremamente grati ai membri del DRASTIC (Decentralized Radical Autonomous Search Team Investigating COVID-19) Gruppo Twitter per tutto il loro lavoro nella scoperta di molti fatti inediti sulla SARS ‐ CoV ‐ 2 e sui relativi ceppi. In particolare, siamo grati a Luigi Warren per aver esaminato continuamente la possibile connessione dell’epidemia di polmonite da Mojiang del 2012 a WIV e SARS ‐ CoV ‐ 2, a @ TheSeeker268 per aver trovato le tesi di laurea Xu MSc 2013 in lingua cinese e di dottorato Huang 2016, che hanno confermato la natura virale simile alla SARS dell’epidemia di polmonite da Mojiang del 2012 e hanno chiarito il ruolo di WIV nell’indagare su quell’epidemia,xxiv inclusa la collezione WIV del ceppo 4991 / RaTG13 dalla miniera di Mojiang, ea Francisco de Asis de Ribera Martin per averci fornito la traduzione in inglese delle due tesi, e anche per aver scoperto le date dell’amplicon RaTG13″ – concludono gli autori dello studio. Rossana Segreto e Yuri Deigin non hanno conflitti di interesse.

 

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Fonti:

https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/bies.202000240

https://www.uibk.ac.at/microbiology/news/2020/sars-cov-2_genetic-structure.html